YouTubeはベンチャーキャピタルが出資するスタートアップ企業として開業した。主な出資者はセコイア・キャピタルであり、2005年11月から2006年4月までの間に1150万米ドルをYouTubeに投資した[10]。当初、YouTubeの本社はカリフォルニア州サンマテオのピザ販売店・日本食レストランの2階に置かれていた[11]。www.youtube.comのドメインは2005年2月14日に有効化された[12]。ハーリーとチェンによれば、最初期のYouTubeは動画版のHot or Not（英語版）（ユーザーが異性の画像をアップロードできる出会い系サイト）を目指しており、その方向性を示したのはカリムだった[8][13]。

YouTubeに初めて投稿された動画は、ジョード・カリムがサンディエゴ動物園の象の前にいる様子を映した 『ミー・アット・ザ・ズー』（2005年4月23日投稿）だった[14][15]。2005年5月、YouTubeのベータ版が一般に公開された。YouTubeで初めて再生回数が100万に達した動画は、ロナウジーニョが出演したナイキの広告動画（2005年11月に達成）だった[16][17]。2005年10月、カリフォルニア州で事業を行うデラウェア州法人としてYOUTUBE, INC.を設立[18][19]。

2005年11月にセコイア・キャピタルから350万米ドルの出資を受け、YouTubeは2005年12月15日から正式なサービスを開始した。正式サービスの開始当時、1日の動画再生回数は約800万回だった[20][21]。YouTubeは急速に成長し、2006年7月の発表では、1日に6万5000本以上の新たな動画がアップロードされており、1日の動画再生回数は約1億回であるとされた[22]。

アメリカでは、2005年12月頃にNBCの人気テレビ番組『サタデー・ナイト・ライブ』がアップロードされていたことからブログなどで話題になり[23]、2006年上旬にはYouTubeの映像をブログなどに貼り付け簡単に見られるAPIも公開され爆発的に普及した。日本では2006年3月に民間調査会社のネットレイティングスの調査で日本国内からの利用者が約212万人に達し、平均利用時間では米国ユーザーを上回っていることが発表された[24]。

2006年4月にアメリカの映画制作会社のワインスタイン・カンパニー、ディメンション・フィルムズと提携し、映画の予告編がYouTubeで配信された[25]。これを初めとして様々な企業や団体がYouTubeにチャンネルを持ち、コンテンツを公開するようになった。2006年10月、YouTubeは本社をカリフォルニア州サンブルーノに移転した[26]。開業当初本社が置かれたカリフォルニア州サンマテオのビル

www.youtube.comというドメイン名を選択したことで、類似するドメイン名www.utube.comの保有者との間でトラブルが生じた。 2006年11月、YouTubeへのアクセスを試みた訪問者によって自社サイトが常に過負荷になっているとして、www.utube.comを保有するUniversal Tube & Rollform Equipment（英語版）社はYouTubeを提訴した。その後、Universal Tube社は自社サイトのドメイン名をwww.utubeonline.comに変更した[27][28]。現在、www.utube.comは、「Error code 522、Connection timed out」と表示される[29]。

YouTubeはサーバ回線コストだけで月間100万ドルに達すると言われていたため、どう収益を上げていくかが注目されていたが[30]、2006年10月9日に16億5000万ドルの株式交換でGoogleの買収に同意した[31][注釈 1]。GoogleによるYouTubeの買収は2006年11月13日に完了した[32][33]。2006年11月、カリフォルニア州で事業を行うデラウェア州法人としてYOUTUBE, LLCを設立[34][35]。「アップロードされた動画に対し厳しい規制が取られてしまうのでは」と一般ユーザーから危惧が持たれていたが、ハーリーは「YouTubeはGoogleに買収されたが、今後もYouTubeとしたブランドで独立したサービスを提供し続ける」と述べた。またGoogle側も類似サービスであるGoogle ビデオのサービスを継続。