進化をはっきりと示す化石証拠はダーウィンの時代には乏しかったが、現在では豊富に存在する。まず全体的なパターンとして、単純で祖先的と思われる生物は古い地層からも発見されるが、複雑で現生種に似た生物は新しい地層からしか見つからない[8]。

化石証拠の豊富な生物については、化石を年代順に並べることで、特定の系統の進化を復元することもできる。プランクトンは死骸が古いものから順に連続的に堆積していくため、このような研究が容易であり、有孔虫や放散虫、珪藻の形態が徐々に進化し、時には種分化する過程が確認できる[9][10]。プランクトン以外にも、三葉虫の尾節の数の進化を示す一連の化石などがある[10]。
ミッシング・リンク魚類と両生類の特徴を併せ持つティクターリクの復元画

進化を否定する創造論者は、分類群間の中間的な特徴を示す化石が得られないことを指して「ミッシング・リンク」と呼んでいる。しかし、分類群間の移行段階と考えられる化石は既に一部得られている[11][12]。

分類群の起源となった種そのものを見つけるのは確かに困難だが、その近縁種の化石があれば、進化過程を解明するのに充分である[11]。たとえば爬虫類と鳥類の特徴を併せ持つ化石には有名な始祖鳥に加えて、多数の羽毛恐竜がある[13][14]。クジラの進化過程は、時折水に入る陸生哺乳類であったインドヒウスに始まり、徐々に水中生活に適応していく一連の化石から明らかになっている[15][16]。

現在の魚類と両生類をつなぐ移行化石としてはエウステノプテロン、パンデリクチス、アカンソステガ、イクチオステガなどが知られていたが、さらにパンデリクチスよりも両生類に近く、アカンソステガよりも魚類に近いティクターリクが2006年に発表された[17][18]。無脊椎動物では、祖先的なハチの特徴と、より新しく進化したアリの特徴を併せ持つアケボノアリなどの例がある[19]。

移行化石は次々と発見されており、たとえば2009年には、鰭脚類（アシカやアザラシ）と陸上食肉類との中間的な特徴を示す化石[20]や、真猿類の祖先に近縁だと考えられるダーウィニウスの化石[21]が報告されている[22]。人類が他の類人猿に似た祖先から進化してくる過程を示す化石も見つかっている[23][24]。
生物地理学から

生物の分布がいかにして成立してきたかを探る分野である生物地理学は、進化を支持する強力な証拠をもたらす。進化生物学者のコイン（英語版）によれば、創造論者は生物地理学上の証拠に反論することができないため、無視を決め込んでいるという[25]。

火山活動などによる海底の隆起によってできた、大陸と繋がったことのない島を海洋島と呼ぶ。ガラパゴス諸島やハワイ諸島、小笠原諸島といった海洋島の在来生物相には海を渡れない両生類、コウモリを除く哺乳類、純淡水魚がほとんど、あるいは全く含まれないのが普通である。それに対して大陸と繋がった歴史のある島には、哺乳類や両生類が普通に分布している。しかも島に棲む生物は、ほとんどの場合最も近い大陸の生物と近縁である。このようなパターンでは、生物が地球の歴史の中でその分布を広げながら進化してきたと考えない限り理解できない[26][27]。

地域が違うと、似たような生息環境であっても異なる生物が分布することがあり、これも進化の証拠となる。同じ砂漠でも新世界にはサボテン科、旧世界にはキョウチクトウ科やトウダイグサ科の乾燥に適応した植物が生息している[28][29]。

ダーウィンの時代には知られていなかったが、地球の歴史上、大陸は長い時間をかけて移動し、離合集散を繰り返してきた（大陸移動説）。生物の分布のなかには、かつて繋がっていた大陸に共通祖先がいて、大陸の分裂に伴って系統が分岐したと考えることでうまく説明できるものも多くある。たとえばシクリッド科の淡水魚や走鳥類の分布は、かつてのゴンドワナ大陸が複数の大陸に分裂した過程で分岐してきたことで成立したと考えられる[30]。

輪状種の存在も、生物がわずかな変化を累積して連続的に進化してきたことの傍証となる。輪状種とは、ある場所では互いに交配せず、別種として区別できる生物が、実は多数の中間型によって連続している場合を指す[31]。ヨーロッパ北西部ではセグロカモメとニシセグロカモメが互いに交配せず別種であると識別できるが、そこから東に向かい、北極の周りを一周してヨーロッパに戻ると、ニシセグロカモメが次第に変化してセグロカモメにいたる一連の亜種が観察でき、明瞭な種の区別はない。
比較解剖学から
相似と相同

進化の証拠は化石だけではなく、現生生物の形態を比較することからも得られている。たとえば陸上脊椎動物は外見上非常に多様であり、コウモリや鳥のように飛翔するものまで含まれる。それにもかかわらず、すべて基本的には同一の骨格を持ち、配置を比較することで相同（進化的な由来を同じくする）な骨を特定することができる。このことは、陸上脊椎動物が単一の共通祖先を持ち、祖先の形態を変化させながら多様化してきたことを示している[32][33]。それぞれの種が独立に誕生したとしたら、鳥の翼と哺乳類の前脚のように全く機能の異なるものを、基本的に同一の骨格の変形のみで作る必然性はない。

機能が異なっていても由来と基本的構造を同じくする相同とは逆に、由来や構造の異なる器官が同一の機能を果たし、類似した形態を持つことを相似という。たとえばコウモリと鳥、翼竜はどれも前肢が翼となっているが、翼を支持する骨は大きく異なっている[34]。鳥は羽毛によって翼の面積を大きくしており、掌や指の骨の多くは癒合して数を減らしているのに対し、コウモリは掌と指の骨を非常に長く発達させて、その間に膜を張ることで翼を構成している。その一方で、翼竜の翼は極端に長く伸びた薬指1本で支持されている。これは、翼を持たなかった共通祖先から、翼を持つ系統がそれぞれ別個に進化してきた（収斂進化）と考えれば合理的に理解できる。
痕跡ガラパゴスコバネウは飛べないが、痕跡的な翼を持つ。

進化がもともとの形態を改変して進んできたのだとしたら、生物には祖先の形態の名残が見られるはずである。実際に痕跡の例は枚挙に暇がなく、飛べない鳥の持つ痕跡的な翼、洞窟に住むホラアナサンショウウオ（英語版）の痕跡的な眼、ヒトの虫垂などが挙げられる[35][36]。