都市近郊路線では珍しく平日・土曜・休日共通ダイヤになっており、日中は12分間隔、早朝と夜間は20分間隔の運転である。

早朝には白糸台駅始発の列車があるが、白糸台行きの列車は設定されておらず、上り列車は全て武蔵境駅行きで、夜間の一部列車は是政駅まで運行した後、白糸台行きの回送列車となって車庫に入る。緊急時には白糸台駅で車両交換（取り替え）となる場合もある。

列車の行き違いは、日中は新小金井駅と白糸台駅で、早朝と夜間は白糸台駅で行う。2019年3月16日のダイヤ改正まで早朝と夜間は多磨駅で行き違いを行っていたが、多磨駅の駅改良工事に伴い列車交換設備を撤去した。
使用車両新101系 ワンマン運転対応改造車
（競艇場前駅、2010年11月）

当線の車両は小手指車両基地に所属し、ワンマン運転に対応した仕様へ改造されている。現在は同仕様の車両が狭山線（かつては多摩湖線）でも運用されており、双方の車両の交換が年4回、JR線を経由する甲種輸送という形で実施される[52]。簡単な検査や車体清掃などは、白糸台駅に併設された白糸台車両基地で行われる。大規模な検査・修繕については武蔵丘車両検修場（かつては旧西武所沢車両工場）で実施するため、本線側に常駐している間に行う。

JR中央線の高架化工事中は、甲種輸送ができなかったため部品の輸送で対応していたが、JR中央線の高架化工事完了後は車両の甲種輸送が再開された（「中央線快速#連続立体交差事業」も参照）。
現用車両

新101系 （2010年 - ）[53]

2010年3月より旧101系の置き換えのため導入開始[42]。車体色を白に変更したワンマン運転対応車を当初から使用している[42]。

導入当初は、車両の投入時期にあわせ「春」「夏」「秋」「冬」の四季をテーマとしたイラストが先頭車両にラッピングされていた[25][54][55][56]。このイラストは沿線の小学生から募集したものである[25][54][55][56]。



「春」ラッピング
（2010年11月）

「夏」ラッピング
（2010年7月）

「秋」ラッピング
（2010年9月）

「冬」ラッピング
（2011年2月）

「春」「夏」ラッピング
（2010年6月）

新101系の塗色変更

2017年から2018年にかけて多摩川線開業100周年を記念し、伊豆箱根鉄道カラー[44]、赤電塗装（西武鉄道の旧塗装）[57]、ツートンカラー（101系デビュー時の塗装）[58]、近江鉄道カラー[59]に塗色変更された新101系が登場した[53]。一部の駅には運行中の各車両のカラーリングを解説するポスターが掲示されていることがある。

伊豆箱根カラー

2017年10月22日に多摩川線が開業100周年を迎えたことを記念し、同年9月29日から年末まで行った記念イベント「多摩川線開業100周年期間」の一環として[44]、同年に創業100周年を迎えた伊豆箱根鉄道とのコラボレーション企画で、伊豆箱根鉄道カラーに塗色変更した編成を運行した[44]。その後は2018年1月24日からは多摩湖線で運行している[57]。


赤電塗装

2018年1月24日からは、多摩川線開業100周年イベント時のアンケートで要望が多かった、西武鉄道の旧塗装「赤電塗装」（西武701系のデビュー当時のレッド×ベージュの塗色）を復刻した編成を運行開始した[53][57]。赤電塗装の編成は、2017年12月17日から2018年1月19日まで多摩湖線で運行した[57]。