その後加持と入れ替わる形でドイツを離れ、第3新東京市NERV本部勤務となる。

テレビ版では使徒殲滅戦の指揮を務める。司令・副司令に次ぐ立場でありながら、サード・チルドレンの出迎えに自ら赴くなど相当アクティブであり、大胆な作戦指揮によって時にはMAGIが撤退を推奨するほどの状況すら勝利に導く。指揮下のEVAパイロットであるシンジ・アスカを家族として自宅に迎え、彼らの親代わりかつ最も近い他人として重要な役割を果たす。しかし物語が進むにつれてEVAや使徒の正体、NERVや委員会の役割に疑問を抱くようになり、自ら真実を追い求めるようになる[9][10][11]。

劇場版ではついにセカンドインパクトの真相に辿り着いたことが示される。戦自襲撃時は当初発令所で指揮を執っていたが、シンジの身に危険が迫るに当たって自ら救出に向かい切り抜ける。しかし道中で銃撃を受けシンジを庇った際に被弾。自分自身にケリをつけ、必ず戻ってくるよう言い含めてシンジをケイジへ送り出し、自身は戦自による区画爆破に巻き込まれて死亡した[11]。
性格

「ちょっち（ね）」が口癖。一人称は基本的に「あたし」。EVAのことを「エバー」と言う。他人のいる場所では子供のように常に明るく振る舞い、よく喋り、周囲の人間の機微にも鋭い社交性を持つが[12]、内面的にはセカンドインパクトの体験が性格に深く影を落としている。

私生活においては、非常にがさつかつ、ずぼらでだらしない面が多い。シンジ・アスカと同居するも、彼らの身の回りの世話は全くしておらず、むしろシンジに家事を任せきりにしていた。そのため、シンジに私生活のだらしなさを指摘された。シンジが来る前は、家の中がゴミで埋まっていた[13]。寝床が万年床となっていたり、机のまわりがゴミで埋もれていたり、ゴミ捨てをシンジに任せる[14]、時計のアラームを足で止める[15]、朝からビールを食卓に持ち出し一気飲みするなど[16]、自宅でのだらしない行動は枚挙に暇がない。料理下手であるらしく、第伍話「レイ、心のむこうに」ではレトルトを素材にカレーを作ったが、シンジ、リツコが悶絶し、ペンペンが気絶する描写がある。特にビールが大好きで、ヱビスビールを愛飲しており、冷蔵庫はほぼこれだけで満杯にされている（作品の後半からは ヱビチュビールへ変更がされている）。ただし、後にビールから缶コーヒーを愛飲するようになる。

しかしEVAの戦闘指揮官として優秀で、一見無茶とも思える作戦も度々提唱するがそのほとんどを結果的に成功に導く強運の持ち主であるが、作中ではシンジに「ミサトさんのクジは当たったことが無い」と言われている。彼女自身の戦闘力も高く、劇場版第25話でH&K G11アサルトライフルを装備した戦略自衛隊員3人を、45口径弾×12発のH&K USP自動拳銃だけで射殺している。ドライビングテクニックにも優れ、第壱話「使徒、襲来」ではシンジを乗せて走っている最中に上から巨大な落下物が降ってきている中を鮮やかに避けている。また勘の鋭い面もあり、NERVやゼーレの裏の目的についても早くから疑念を抱いていた。

研究を優先し家族を顧みなかった父を嫌っていたが、セカンドインパクトの際に命を救われたため複雑な感情を抱いている。使徒殲滅に対する強い執着も、「（父の呪縛から抜け出すために）父に復讐したいのかもしれない」「使徒に復讐することで（父への思いを）誤魔化していた」とミサトの自白によって語られる。加持に好意を抱いたのも、NERVに入ったのも父を追い求めていたからだという。
交流
碇シンジ
シンジと同居を始めたのは、孤独な彼に同情した行為からであった。公式の場では「シンジ君」と呼ぶが、プライベートでは「シンちゃん」となる。年齢的に姉と母の中間になるが、綾波レイとの関係を冷やかしたり、年上の友達としてくだけた付き合い方もしている。アルミサエル戦でレイが死亡した時は、傷心のシンジと身体的接触を試みるが、結局シンジに拒否された[17]。劇場版第25話でも、死の直前に恋人のような会話を交わす。このようにシンジとの関係は、親・姉・友・恋人と多面的な側面を持っている。シンジを家族のように大切に思っている[18]。
惣流・アスカ・ラングレー
ネルフ移籍の際にパイロットの親交を深めるためミサトの家に住まわせる。アスカ登場初期は良い関係を築いていたように見えたが、ネルフ移籍前に加持に「ミサトのことは好きじゃない」と伝えていた。ミサトと加持の関係が回復した後は関係が一気に悪化。その後、関係は回復しないまま劇場版第25話でミサトは死亡する。
赤木リツコ
大学時代の友人で現在は同じネルフの同僚。ネルフの科学者。価値観の相違などから意見が対立することもしばしばある。
加持リョウジ
ミサトとリツコの大学時代の友人。大学時代は付き合っていたがミサトが加持を死んだ父に重ねていたことに気付いて、一度別れる。その後は意地悪な態度をとりながらも、憎からず思う関係となる。
その他

第弐話ではビール缶のラベルは「YEBISU」であったが、第七話からは「YEBICHU」となっている[注 5]。これは伊藤理佐の漫画作品『おるちゅばんエビちゅ』のパロディであり、ビールの缶にもエビちゅの絵が描いてある。