愛車は旧世紀版と同じくアルピーヌ・A310の右ハンドル[注 8]だが第7の使徒戦で2号機の着地に巻き込まれ、以降はマツダ・コスモスポーツ[注 9]に乗る。携帯電話の着信音に科学特捜隊作戦室の電話の音を使用している。

旧世紀版と性格や振る舞いに大きな差はなく、シンジとアスカ[注 10]を自宅に住まわせ家族のように接する。私生活のだらしなさもそのままだが、EVA搭乗に投げやりなシンジに手を上げかけて自分の頬を平手打ちする、家出から戻ったシンジに「嫌ならここから出て行ってもいい」「乗るかどうか自分で決めなさい」と諭すなどシンジに対する応対に変化がある。また、アスカの加持に対する恋心がないためアスカとの対立もなくなっている。
:Q、シン・

反NERV組織「WILLE（ヴィレ）」のリーダーかつ空中艦隊旗艦「AAAヴンダー」の艦長で階級は大佐。43歳。

髪を後ろに流して団子にまとめ、サングラスを着用し常に制服を着こんでいる。当初は他の構成員と違って青いバンダナは身に着けていなかったが、ヤマト作戦を前にして加持の遺品である血痕の付いたバンダナを着用した。『:破』の後に加持との間に息子をもうけ「加持リョウジ」と名付けたが、一生会わないと決めており両親のことも教えていない。

NERV殲滅のためならば手段を厭わず、アスカをして「目的優先・人命軽視がモットー」と言わしめる。ニアサードインパクトの責任をシンジが全て負う形になってしまったことを後悔しており、今度は全て自分で抱え込もうとしていた。シンジに対しては冷淡に接しようとしていたが、シンジがNERVに誘拐された際に促されてもDSSチョーカーを作動させられないなど情を捨てきれずにおり、シンジがヴンダーに戻った時は「戻ってきてくれたと喜んでいる」とリツコに指摘されている。

人類補完計画阻止のために奮闘するも力及ばず、自らEVAに乗り父親との対決を選んだシンジに未来を託した。最後は残された人々をリツコに、シンジをマリに託し、自らの命と引き換えに槍をシンジの下へ届けた。カヲルと会話する加持の最後のセリフにて魂の救済（新世界への転生）が暗示されているが登場シーンは無い。
ゲーム版

『新世紀エヴァンゲリオン2』では、条件を満たしていると戦略自衛隊の攻撃で死亡しない。その場合は戦略自衛隊の兵士を予め通路に仕掛けておいた爆薬で爆殺し、チルドレンを無事にEVAの元に送り届け、発令所に戻って量産機戦の指揮を執るといったストーリー展開になる。

『名探偵エヴァンゲリオン』では、特務機関NERV戦術作戦部作戦局第一課所属一尉であると同時に、シンジたちが通う学校の教師も兼任している。また、本作品では唯一シンジたちの敵になるというエピソードがある。

プレイステーション3にて、ニュース読み上げサービスソフト『葛城ミサト報道計画』が2009年6月6日より配信されていた（2010年6月5日サービス終了）。ミサトがニュースキャスターに就任し、インターネット経由で配信されるニュースを読み上げるという設定である。演じる三石琴乃の声をサンプリングした合成音声による読み上げのため、通常のニュース原稿読み上げとはアクセントやイントネーションに違いが出る。

「スーパーロボット大戦シリーズ」に『エヴァ』が登場する際にはミサトも登場している。主に部隊の司令官であるブライト・ノアの参謀役を務めることが多いが、そのうちの1つ『スーパーロボット大戦Scramble Commander』では実質的な主人公として登場する[22]。
名前の由来

「葛城」は大日本帝国海軍雲龍型航空母艦「葛城」、「ミサト」は成田美名子の漫画の主人公から[23]。
その他

キャラクターデザインの貞本義行によると、キャラクターのイメージは『ルパン三世』（旧シリーズ）の峰不二子を基にして、前髪のデザインをアニメ『美少女戦士セーラームーン』の月野うさぎから拝借したもの。その後、担当の声優が同じ三石に決まったことを聞き苦笑いをした[24]。庵野秀明は、「何かの宴会で三石の姿を見て、葛城ミサトのキャラクターイメージを得た」と語っている。また設定資料集には、杉本彩みたいなルックアイとの記述がある[25]。

2012年10月、動画共有サービス「ニコニコ動画」とヱヴァンゲリヲン新劇場版のコラボレーションが実現し、動画閲覧ページと生放送ページが「ニコニコ動画：Q」「ニコニコ生放送：Q」にバージョンチェンジした。その中で、閲覧しようとした動画が削除されていた場合、その旨を案内するナレーターを務めている。