一般に、培養が進行すると分割し続けた細胞が培地全体に広がるため、以下のような問題が発生する。

培地成分の枯渇


培地のpHの変化


アポトーシス/ネクローシスによる死細胞の蓄積


細胞同士の接触により細胞周期が停止し、細胞分裂が止まる接触阻止


細胞同士の接触による細胞分化の発生


遺伝的及びエピジェネティックな変異：　自然選択によって、培養条件に適応した、分化能が低く増殖性が高い異常な細胞が過剰に成長することがある[15]。

培養した細胞の操作

細胞培養に共通する操作には、培養液の交換、継代、トランスフェクションがあり、一般に無菌操作に依る組織培養の方法で行う。無菌操作を安全キャビネットもしくはクリーンベンチ中で行うことでバクテリア、酵母、他の細胞株の混入による汚染を回避する。抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシンなど）や抗菌剤（アムホテリシンBなど）を培地に加えることがある。

細胞が代謝の過程に入ると酸が生産されpHが低下する。しばしば栄養の枯渇の程度を計るために、酸塩基指示薬が加えられる。
培養液の交換

接着培養の場合、培地は直接吸引により取り除き、交換する。非接着培養においては、遠心分離した後、新しい培地に細胞を再度分散する。
継代

継代は、少量の細胞を新しい容器に移す作業を伴う。定期的に分割することで、高い培養密度の継続による老化を回避し、細胞をより長く培養することができる。分散培養では、少量の培養液を大量の新鮮な培養液で希釈することで、容易に継代することができる。接着培養では、細胞の剥離から始める必要があり。剥離は一般にトリプシン-EDTA混合液を用いるが、現在では他の酵素混合溶液も同様の目的で使用される。少数の剥離した細胞が新しい培養に用いられる。ある種の細胞は、ゴムベラで培養容器の内壁表面から機械的に掻き取り集める場合もある。
トランスフェクションと形質導入詳細は「トランスフェクション」および「形質転換」を参照

トランスフェクションは、外部遺伝子を導入するためによく用いられる細胞操作である。トランスフェクションにより、目的タンパク質を細胞に遺伝子発現させることができる。近年では、RNAi構造体のトランスフェクションが、特定の遺伝子やタンパク質の発現を抑制するための簡便な方法として実現されている。DNAは形質導入、感染、形質転換と呼ばれるウイルスを用いた方法で、細胞内に挿入することができる。DNAの挿入は、ウイルスが通常増殖する際に使用している過程の一部であるので、ウイルスはDNAの細胞への導入ための寄生作用剤として適している。
樹立ヒト細胞株ヘキスト染色剤によって細胞核が青く染色されたHeLa細胞の培養細胞。HeLa細胞は最初期に樹立された細胞株の1つであり、子宮頸癌で他界したヘンリエッタ・ラックスの腫瘍から取り出された細胞が起源である。

ヒトを起源とする細胞株は、その元になる生体から切り離されて生き続け、のちに利益を生み出す医学的処置の発見につながることから、生命倫理学において議論の対象となってきた。この分野における先駆的決定において、カリフォルニア州最高裁判所は、Moore v. Regents of the University of Californiaにおいて、インフォームドコンセントを受けた患者は、切除された器官から得られた細胞株に対して所有権を持たないことを判示した[16]。詳細は「ハイブリドーマ」を参照

通常の細胞と不死化細胞株を融合させることが可能である。この方法は、モノクローナル抗体の生産に使用されている。端的に言って、免疫動物の脾臓(もしくは血液)から単離されたリンパ球は、不死化された骨髄腫細胞株（B系細胞）と合わせられ、初代リンパ球の抗体特異性と骨髄腫の不死性を持ったハイブリドーマを生産する。選択培地（HAやHAT）を用いると、融合していない骨髄腫細胞は成長せず、初代リンパ球は培地中で急速に死滅し、結果融合した細胞のみが生き残る。融合した細胞は必要な抗体の生産のためにスクリーニングされる。
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