19世紀になって、ルイ・パスツールは細菌の液体培養法を確立したことで、細菌学の進展に大きな貢献を果たした。当初、彼は医学ではなく醸造学の分野から発酵の研究に携わり、そこから自然発生説の検証へと進んでいったが、微生物の活動が意外に大きな影響力を持つこと、それが空気中などに多数飛散していることを明らかにし、それらが発酵などの役に立つ面と、食品の腐敗などの有害な面の、両方の面からヒトの生活に関わっていることを見いだした。さらに彼は、この考えを医学の方向にも発展させ、微生物が作り出す腐敗物質が一種の毒素としてヒトに作用することで病気が発生するのではないかという説を唱え、空気中の埃には微生物が多数いること、それらの中にはどんな危険なものが含まれているかもしれないとの懸念を発表した。このパスツールの考えはコンタギオン説を支持するものであり、細菌こそがコンタギオン説に言う「生きた伝染性生物」の本体であるという説（細菌説）という新しい概念を示した。また同時に、腐敗という現象を明らかにしたことでその病原性のメカニズムをも説明しようとするものであった。

1865年、パスツールは南フランスの養蚕業者からカイコの病気の対策について指導を求められ、その原因となる微粒子病の原因となる微生物を発見した。これが最初に発見された病原体であるとも言われる。しかしながら、パスツールの液体培養法では複数の細菌が混じった状態での培養しかできず、病原菌を単独で分離培養することができなかったため、これもまた病原体を実験的に証明したことにはならなかった。

パスツールによる腐敗現象の発見は、決定的な証明にこそならなかったもののコンタギオン説にとって大きな支えになった。しかしこれに対して、マックス・フォン・ペッテンコーファーは、従来のミアズマ説にパスツールの発見を取り入れた環境説という新しい概念を提唱して反論した。ペッテンコーファーは下水道の整備によってさまざまな疫病の発生を食い止めたという実績から、環境（特に土壌）汚染との関連が説明しやすいミアズマ説を支持していた。パスツールの細菌説は、(1)細菌がヒトに感染し、(2)ヒトの体内で腐敗物質を作り出し、(3)その腐敗物質が毒素になり発病する、という考えであったが、これに対してペッテンコーファーは、(1)ヒト体内の細菌（これはそのままでは病原性を持たない）が排泄されて土壌や水を汚染し、(2)汚染した細菌が土中や水中で増殖して腐敗物質を作り出し、(3)その腐敗物質がミアズマとしてヒトに作用して発病させる、という考えを示した。
コッホによる実験的証明

パスツールにやや遅れて、ドイツのロベルト・コッホが医学の分野から、病原体としての細菌の研究を開始した。コッホは切ったジャガイモの断面でのカビの生え方をヒントに、液体培地をゼラチンなどで固めた固体培地を発明して細菌の固体培養法を確立した。固体培養法では液体培養法とは異なり、病原菌と他の細菌の混じり合った中から、それぞれを独立した別のコロニーとして分離し、純粋培養を行うことが可能となったため、分離した一種類の細菌についてのみ、その病原性を研究することが、ようやく可能になった。

コッホはこの手法を用いて、学生時代の恩師の一人であったヤーコプ・ヘンレが提唱していた、病原体を証明するために必要な三つの原則（ヘンレの原則、コッホの原則の1-3に対応）に従い、細菌説の証明に取り組んだ。そして1876年に、炭疽症を起こした動物から分離した炭疽菌の病原性について、ヘンレの原則を満たすことを示した。また、この後にさらに実験感染した動物の体内から炭疽菌が分離できることも証明し（コッホの原則の第4条件にあたる）、細菌説が科学的に正しいことを実験的に証明した。

さらにコッホは1882年に、ヒト結核の病原体として結核菌を分離し、ヒトの病気についても細菌説が正しいことを実験的に証明した。これと同時に4条件からなるコッホの原則を公表した。この原則は、以下の4つの条件から成り立つ。
ある一定の病気には一定の微生物が見出されること

その微生物を分離できること

分離した微生物を感受性のある動物に感染させて同じ病気を起こせること

そしてその病巣部から同じ微生物が分離されること

この4つの条件をすべて満たすことが、ある微生物が特定の病気の病原体であることの厳密な条件となる。これを受けて、医学研究者らの関心が一気に細菌学に向けられることになり、20世紀の当初までに、主要な伝染病の病原体が発見されていった。

ただし、コッホ以降の医学の進展によって、この条件のすべては満たさない（2つか3つの条件のみを満たす）場合でも、他の疫学研究などの知見と併せて、病原体として認められた微生物もある。

一方、環境説を支持していたペッテンコーファーは、コレラの病原体が細菌であるとする説に異を唱えて、1892年にコレラ菌を自ら飲む自己実験を行うことで自説の正しさを証明しようとした。この結果、ペッテンコーファー自身は激しい下痢を起こしたものの、コレラの主症状とされる脱水症状を起こさなかったため、細菌説の正しさに対してクレームがつけられる結果となった。しかしその後、他の研究者による追試の結果などから、最終的には、病原菌の毒性と宿主の抵抗性の、力のバランスによって発病するかどうかが決まることが次第に明らかになり、さらにその欠点を補いながら、細菌説の方がより正しい学説であることが証明されていくことになり、長く続いた環境説やミアズマ説との論争に決着がつけられた。

発見の経緯から、19世紀には病原体はすべて細菌であると考えられていたが、その後、微生物学の発展に伴ってその分類が進み、真正細菌だけでなく菌類や原生生物にも、宿主に病気を起こす性質（病原性）を持つものが見つかった。また細菌を取り除くことが可能な素焼き陶器製の濾過器を通過しても病原性が残る濾過性病原体として、ウイルスが発見され、病原体には細菌以外にも、さまざまな微生物、ウイルスが含まれることが明らかになった。
主要病原体の発見史

病名発見年病原体発見者
ハンセン病1875年アルマウェル・ハンセン（ノルウェー）
炭疽菌（炭疽症）1876年ロベルト・コッホ（ドイツ）
マラリア1880年シャルル・ルイ・アルフォンス・ラヴラン（フランス）
腸チフス1880年カール・エーベルト（ドイツ）
結核1882年ロベルト・コッホ（ドイツ）
コレラ1883年ロベルト・コッホ（ドイツ）
ジフテリア菌（ジフテリア）1883年エミール・フォン・ベーリングと北里柴三郎
破傷風1884年アルトゥール・ニコライアー（ドイツ）
ブルセラ症1887年デビッド・ブルース（イギリス）
ペスト1894年アレクサンドル・イェルサン（フランス語版）（フランス）、北里柴三郎（日本）
赤痢1898年志賀潔（日本）
梅毒1905年フリッツ・シャウディン（ドイツ語版）（ドイツ）
百日咳1906年ジュール・ボルデ（フランス）
チフス1909年シャルル・ジュール・アンリ・ニコル（フランス）

対策の歴史

病原体に対する的確で有効な対策として、最も古いものはジェンナーが種痘法を開発したことであるが、彼はその機構についての理解がなかったので、応用はできなかった。ジョゼフ・リスターによる消毒法は、手術等の際の細菌感染による敗血症などの発生を抑えるのには大きな効果があったが、これも一般の感染症に対応できるものではない。

病原体が発見されたことで、対策を講じるべき対象がはっきりしたわけであるが、実際に具体的な対応策が発見されたわけではない。パスツールのカイコの微粒子症にせよ、コッホによる炭疽菌の発見にせよ、ひとまず考えられたのは、病原体をもつ個体やそれに触れた周囲のものを燃やす、あるいは埋めるという対策であって、これはそれ以前に行なわれていた対応とほとんどかわらないものである。わずかにコッホによる、炭疽菌は低温では働かなくなるとの発見が合理的裏付けとなったにすぎない。

本格的に役に立つ対応策の最初のものは、パスツールによる炭疽菌ワクチンの開発である。これは、根本的には種痘と同様のものだが、まず弱毒化させた病原体を接種して、動物体に免疫をつけさせるという理論的裏付けができたので、応用が利いた。彼はその後狂犬病やニワトリコレラのワクチンも開発した。この技術によって多くの伝染病に対して予防接種で対抗することが可能となった。また、北里らによる血清療法は、この原理に基づきながら、応用の幅を大きく広げたものである。