1940年になってフランスが敗北し、ドイツが俄然有利になると三国同盟の締結論が再び盛り上がってきた。陸軍ではこの「バスに乗り遅れるな」という声が高まり、本国が敗北し亡命政府の統治下となったオランダ領インドネシアや、イギリス領マレー半島を確保しようとする「南進論」の動きが高まった。陸軍首脳は親英米派の米内内閣倒閣に動き、近衛文麿を首班とする第2次近衛内閣が成立した。陸軍は独伊との政治的結束などを要求する「情勢ノ推移ニ伴フ帝国国策要綱」案を提出し、近衛もこれを承認した。近衛内閣には外相として松岡洋右が入閣したが、松岡は日・独・伊・ソ4か国同盟を主張していた。一方、農相の石黒忠篤らは反対派だった。9月5日には吉田善吾が病気を理由に海相を辞任し、後任に及川古志郎が就任した。

9月7日にはドイツから特使ハインリヒ・スターマーが来日し、松岡との交渉を始めた。スターマーはヨーロッパ戦線へのアメリカ参戦を阻止するためとして同盟締結を提案し、松岡も対米牽制のために同意した。松岡は南進論を選んだ際にアメリカが対日戦を考える可能性は高く、同盟を結んでも阻止できる確率は「五分五分」と見ていたが、現在のままでは米英のいいなりになると主張、同盟締結を強硬に主張した。近衛もほぼ同意見で、9月13日の四相会議、14日の大本営政府連絡会議、16日の閣議を経て同盟締結の方針が定まった[19]。しかし一方で松岡は、条約が想定しているドイツ・アメリカ戦争について、日本が自動的に参戦することを避けようとしていた。松岡と自動参戦の明記を求めるスターマーの交渉の結果、条約本文ではなく交換公文において「第三条の対象となる攻撃かどうかは、三国で協議して決定する」こととなり、自動参戦条項は事実上空文化した[20]。及川海軍大臣も近衛・松岡・木戸らの説得により条約締結賛成にまわった。及川が述べた賛成理由は「これ以上海軍が条約締結反対を唱え続けることは、もはや国内の情勢が許さない、ゆえに賛成する」という消極的なものだった。また及川とともに松岡らの説得を受けた海軍次官の豊田貞次郎は、英独戦への参加義務や、米独戦への自動参戦義務もないことで、「平沼内閣時に海軍が反対した理由はことごとく解消したのであって、（三国同盟が）できたときの気持ちは、他に方法がないということだった」と回想している[21]。

9月15日に海軍首脳会議が開かれたが、阿部勝雄軍務局長が経過を報告し終わると、伏見宮軍令部総長が「ここまできたら仕方ないね」と発言、大角岑生軍事参議官が賛成を表明、それまで同盟に反対していた山本五十六連合艦隊司令長官は「条約が成立すれば米国と衝突するかも知れない。現状では航空兵力が不足し、陸上攻撃機を二倍にしなければならない」と発言して会議は終わった[22]。

同盟締結の奏上を受けた昭和天皇は「今しばらく独ソの関係を見極めた上で締結しても遅くないのではないか」と危惧を表明したが、近衛首相は「（ドイツを）信頼致してしかるべし」と奉答した。天皇は続いて「アメリカと事を構える場合に海軍はどうだろうか。海軍大学の図上演習ではいつも対米戦争は負けると聞いた」と、戦争による敗北の懸念を伝えたが、近衛は日露戦争の際に伊藤博文首相が「万一敗北に至れば単身戦場に赴いて討ち死にする」と語ったことを引き合いに出し、及ばずながら誠心奉公すると回答した。これを近衛から伝え聞いた松岡や中野正剛らは号泣したという。ただし伊藤の話は金子堅太郎から近衛が聞いたというもので、西園寺公望はそもそも疑わしいと見ていた[23]。昭和天皇は調印三日前に木戸幸一内大臣に、三国同盟は「日英同盟の時のようにただ慶ぶというのでなく、万一情勢の推移によっては重大な危局に直面するのであるから、親しく賢所に参拝して報告するとともに、神様のご加護を祈りたい」と話したという[24]。

9月19日の第三回御前会議で原嘉道枢密院議長は「…本条約は米国を目標とする同盟条約で、これを公表することにより、米国の欧州戦線への参戦を阻止しようとする独伊の考えである。米国は最近、英国に代り東亜の番人を以て任じ、日本に対し圧迫を加えているが、なお日本を独伊側に加入せしめないため、かなり手控えているだろう。然るにこの条約発表により、日本の態度が明白となれば、日本に対する圧迫を強化し、極力蒋介石を援助して日本の事変遂行を妨ぐるだろうし、又、独伊に対し宣戦していない米国は、日本に対しても経済圧迫を加え、日本に対し石油、鉄を禁輸する共に、日本より物資を購入せず、長期にわたり日本を疲弊、戦争に堪えざるに至らしむる如く計るだろうと考える…」と質問した。またヨーロッパ戦線にアメリカが参戦した際に日本が参戦しなければならないのかという議論もあったが、松岡は手続き上の問題が残されていると言って押し切り、同盟締結は正式に決定された。

9月26日の枢密院では深井英五顧問官は「条約の前文には、万邦をしてその所を得しむとあるが、ヒットラーは嘗て『他の民族に対し弱肉強食は天地の公道なり』と揚言しており、思想観念が相反するではないか」と述べ、石塚英蔵顧問官は「ドイツ国との条約は過去の経験上、十全を期し難し、政府は如何にして彼の誠意を期待し得るか」と警告し、石井菊次郎は「由来、ドイツと結んで利益を受けた国はない。…ヒットラーも危険少なからぬ人物である。わが国と防共協定を結んでおきながら、それと明らかに矛盾する独ソ不可侵条約を結んだ…」と述べた。しかし結果的には承認された。

9月27日、東京の外相官邸とベルリンの総統官邸において調印が行われた。
日独伊三国間条約の原文日独伊三国同盟条約調印書（日本語版）

条約原文は英文テキストでこれにベルリンで署名調印され、約3週間後に日本で印刷されたテキストを駐日ドイツ大使館クーリエに依りドイツに運ばれ改めて署名調印された。現在見られるのは後者の方で 外務省外交史料館 に展示されている。

条約調印式はベルリンで行われ、ドイツ外相ヨアヒム・フォン・リッベントロップ、イタリア外相ガレアッツォ・チャーノ、日本からは特命全権大使の来栖三郎が条約に調印した。

条約の正式名称は、日本語では「日本國、獨逸國及伊太利國間三國條約」（昭和十五年條約第九號、日獨伊三國同盟條約）という。日本國、獨逸󠄁國及󠄁伊太利國間三國條約󠄁大日本帝?國政府、獨逸󠄁國政府及󠄁伊太利國政府ハ萬邦󠄁ヲシテ各其ノ所󠄁ヲ得シムルヲ以テ恆久平󠄁和ノ先決要󠄁件ナリト認󠄁メタルニ依リ大東亞及󠄁歐洲ノ地域ニ於󠄁テ各其ノ地域ニ於󠄁ケル當該民族ノ共存共榮ノ實ヲ擧ケルニ足ルヘキ新秩序ヲ建󠄁設シ且之ヲ維持センコトヲ根本義ト爲シ右地域ニ於󠄁テ此ノ趣旨ニ據ル努力ニ付相互ニ提攜シ且協力スルコトニ決意󠄁セリ而シテ三國政府ハ更󠄁ニ世界到ル所󠄁ニ於󠄁テ同樣ノ努力ヲ爲サントスル諸󠄀國ニ對シ協力ヲ吝󠄁マサルモノニシテ斯クシテ世界平󠄁和ニ對スル三國終󠄁局ノ抱󠄁負󠄁ヲ實現センコトヲ欲ス依テ日本國政府獨逸󠄁國政府及󠄁伊太利國政府ハ左ノ通󠄁協定セリ

第一條　日本國ハ獨逸󠄁國及󠄁伊太利國ノ歐洲ニ於󠄁ケル新秩序建󠄁設ニ關シ指導󠄁的󠄁地位ヲ認󠄁メ且之ヲ尊󠄁重ス
第二條　獨逸󠄁國及󠄁伊太利國ハ日本國ノ大東亞ニ於󠄁ケル新秩序建󠄁設ニ關シ指導󠄁的󠄁地位ヲ認󠄁メ且之ヲ尊󠄁重ス
第三條　日本國、獨逸󠄁國及󠄁伊太利國ハ前󠄁記ノ方針ニ基ク努力ニ付相互ニ協力スヘキコトヲ約󠄁ス更󠄁ニ三締約󠄁國中何レカノ一國カ現ニ歐洲戰爭又ハ日支紛󠄁爭ニ參入シ居ラサル一國ニ依テ攻?セラレタルトキハ三國ハ有󠄁ラユル政治的󠄁、經濟的󠄁及󠄁軍事的󠄁方法ニ依リ相互ニ援󠄁助スヘキコトヲ約󠄁ス
第四條　本條約󠄁實施ノ爲各日本國政府、獨逸󠄁國政府及󠄁伊太利國政府ニ依リ任命セラルヘキ委員ヨリ成ル混合專門委員會ハ遲滯ナク開催セラルヘキモノトス
第五條　日本國、獨逸󠄁國及󠄁伊太利國ハ前󠄁記諸󠄀條項カ三締約󠄁國ノ各ト「ソヴィエト」聯邦󠄁トノ間ニ現存スル政治的󠄁?態ニ何等ノ影響󠄃ヲモ及󠄁ホサヽルモノナルコトヲ確認󠄁ス
第六條　本條約󠄁ハ署󠄀名ト同時ニ實施セラルヘク、實施ノ日ヨリ十年間有效トス右期󠄁間滿了前󠄁適󠄁當ナル時期󠄁ニ於󠄁テ締約󠄁國中ノ一國ノ要󠄁求ニ基キ締約󠄁國ハ本條約󠄁ノ更󠄁新ニ關シ協議スヘシ
右證據トシテ下名ハ各本國政府ヨリ正當ノ委任ヲ受󠄁ケ本條約󠄁ニ署󠄀名調󠄁印セリ

昭和十五年九月󠄁二十七日?チ一九四〇年、「ファシスト」?十八年九月󠄁二十七日伯林ニ於󠄁テ本書三通󠄁ヲ作成ス
締結直後の反応「仲良し三国」?1938年の日本のプロパガンダ葉書はドイツ、イタリアとの日独伊三国防共協定を宣伝している

条約締結後の外務省情報部長須磨弥吉郎は10月4日、「9月27日は日本のみならず世界の史的転換への一日であった」とラジオ演説を行い、条約の意義を強調した。当時アメリカは第三条の自動参戦条項が松岡によって骨抜きにされていたことを知らず、対日警戒感をいっそう強めた。[25][注釈 1]

条約締結を知った駐日アメリカ大使ジョセフ・グルーは日米両国の友好関係継続は「絶望」になったとみなし、「これは、過去に私が知っていた日本ではない」と嘆いた。