1890年（明治23年）、神明浦と相島（おじま、現在のミキモト真珠島）の2箇所で実験を開始した。この時小川多門、猪野三平等が協力した。問題は山積しておりアコヤ貝についての問題、どんな異物を貝に入れるか、貝は異物を吐き出さないか、貝は異物を何処に入れるか、その結果死なないか、貝そのものの最適な生育環境、赤潮による貝の絶滅への対応策等々である。その他の問題としては、海面及び水面下を利用する為の地元漁業者や漁業組合との交渉や役所との折衝には大変な苦労が伝えられている。

1891年（明治24年）、農商務省技手・山本由方による広島県厳島での真珠養殖実験を直接見聞。この時のアコヤ貝は英虞湾から幸吉らが移送に協力した。

1892年（明治25年）7月、東京帝大の佐々木忠次から貝の生存環境・養成上多くの示唆を得た。
縁者の協力

1893年（明治26年）7月11日、実験中のアコヤ貝の中に半円真珠が付着している貝を発見した。

1896年（明治29年）1月27日、半円真珠の特許（第2670号）取得で世の中に認知された第一歩となった。同年4月21日、妻・うめが32歳で死去。開拓者として当然の事ながら周囲は途方も無い事と感じ直接的に幸吉の作業を手伝う者は身近な親族だけであったが、特許取得をきっかけにまず親族が積極的に関わった。妻の兄であった久米楠太郎、幸吉の次弟・御木本松助夫妻、三弟・森井常蔵夫妻、須藤卯吉、1897年（明治30年）秋には幸吉の五弟・斎藤信吉、1899年（明治32年）には竹内久吉、猪野若造（猪野三平の子息）、藤田嘉助、大谷幸助らが従業員として田徳島（現・多徳島）に移住、「海のものとも山のものともわからぬ事業に一身をかける人間は身内以外にはいなかった」と幸吉の四女・乙竹あいが後に語っている。対して、大林日出雄『御木本幸吉』には「『ヒモのつく恐れのある出資は彼の事業独占を制約することがある』と考えたのではないか」と書かれていて、幸吉が大口出資を断った事実があることを記している。

その他研究には元歯科医だった桑原乙吉、次女みねの夫・西川藤吉が加わる。西川は東京帝大動物学科卒、農商務省に在籍し、箕作の下で真円真珠の科学的研究を行っていたが、1905年（明治38年）の赤潮の調査をきっかけに御木本の元で研究を始めた。しかし1909年（明治42年）6月、35歳で死去。同時代の研究者に見瀬辰平、西川藤吉の研究を引き継いだ藤田輔世、藤田昌世らがいる。
出店の歩み

1899年（明治32年） 東京府東京市京橋区弥左衛門町に御木本真珠店（本店）を開設。

1902年（明治35年） 御木本真珠店を京橋区元数寄屋町に移転。

1906年（明治39年） 御木本真珠店を京橋区銀座四丁目に移転。

1907年（明治40年） 市川源次郎専属下請工場を買収し、京橋区築地に御木本金細工工場を開設。

1908年（明治41年） 御木本金細工工場を東京市麹町区内幸町に移転。

1913年（大正2年） ロンドン支店を開設。大阪府大阪市東区淡路町に大阪支店を開設。

1916年（大正5年） 中国視察にでかけ、上海支店を開設。

1919年（大正8年） 東京市芝区三田豊岡町に貴金属第二工場を開設。

1921年（大正10年） 本店横に御木本装身具店を開設。

1923年（大正12年） 貴金属工場を統合して真珠店工場とする。

1927年（昭和2年） ニューヨーク支店を開設。

1928年（昭和3年） パリ支店を開設。

1929年（昭和4年） ボンベイ支店を開設。

1931年（昭和6年） ロサンゼルス支店を開設。大阪支店を閉鎖し、兵庫県神戸市神戸区仲町に神戸支店を開設。

1933年（昭和8年） シカゴ支店を開設。

1937年（昭和12年） ロサンゼルス支店を閉鎖し、サンフランシスコ支店を開設。

1942年（昭和17年） 内幸町工場を東京市目黒区上目黒に移転。

特許取得

1896年（明治29年）、特許第2670号真珠素質被着法の特許権を取得した。半円真珠の特許といわれているものである。

「真珠と甚だしく等差のない物質、例えば貝殻、硝子、陶磁器または下等の真珠を球形の小粒と成したるものを核となし、これを球のまま、または一部切り落としを設けてその転動することを防ぐようにし食塩にて振揺するか又は濃厚な食塩水に浸したあと、生活せる貝の外套膜に接して挿入し、この核に真珠質を被着せしめ真珠を形成せしむるにあり」（特許第2670号 明治29年1月27日 明治27年11月出願）

この特許取得によって真珠事業の独占が可能となり、御木本は他の事業を整理し、真珠事業に専念することとなった。この後、これにならって真珠養殖を行う者が現れ、幸吉は北村幸一郎他2名を特許侵害で訴えたが大審院で無罪判決が下った。裁判の過程でこの特許の大部分は幸吉が出願した以前から公刊物により周知の事実であったとされた。この無罪判決によって、御木本幸吉の独占の時代が終わり、真珠養殖が大きく広まったとされる。紛争は続いたが特許の存続期間が終了して問題はなくなった。

1916年（大正5年）、特許第3002号真珠素質被着法の特許権を取得。

「本発明は適宜の核を貝の真珠素質分泌細胞組織の皮膜に被包し之を生活せる真珠貝の外套膜の表皮を剖き其部分に密接して圧着し適当時間之を放置したる後海中に放養するときは植皮的に付着発育せしめて容易に真珠袋を形成せしめ核を排出することなく完全なる球形真珠を作り得るにあり。（下略）」（特許第3002号 大正5年9月11日、大正5年5月3日出願）

なお真円真珠についての特許は幸吉の次女の婿である西川藤吉が出願し、相続人である西川真吉が取得したものがある。また桑原乙吉の発明が御木本幸吉名義で出願登録されたものも多い。

御木本幸吉が取得した主要な特許をたどると、
半円真珠から真円真珠に到る特許

特に半円真珠に関わる加工上の特許（容飾真珠）

アコヤ貝養殖方法に関する特許（養殖籠・海底いけ籠）

1924年（大正13年）、母貝が子貝を生み育てる為の《仔蟲（しちゅう）被着器》の特許（この発明によって、アコヤ貝の全滅を救う当初の目的が達成されるようになった）

がある。
人々の協力

1896年（明治29年）4月の妻・うめの死は痛手であったが、天性の社交性と熱意により多数の人々が幸吉を応援している。養殖に関して一目置いていたのは、7歳年下の小川小太郎（1865年 - 1889年）であった。小川は早くから真珠の養殖に関心を持ち実験もしていたが、24歳で没した。

志摩国答志郡の郡長であった河原田俊蔵は勧業に熱心だった事から勧業郡長とあだなされ、柳に紹介状を書いてくれた。

四日市の万古焼商人だった親友の川村又助はアコヤ貝の中に入れる核の製造に関し協力を惜しまなかった。藤田四郎（1861年 - 1934年）は同郷で藩校・尚志館の句讀師（漢学者）龍蔵の四男、東京帝大卒、農商務省特許局長で（のち事務次官、日本火災社長、台湾製糖社長）、宮内省御用達となる際の保証人になった。

他にも愛知県出身の農商務省局長・織田一（1865年 - 1914年）、埼玉県深谷出身の財界の重鎮・渋沢栄一は幸吉の渡米にあたって発明王・エジソンらに紹介状を書いた。エジソンとの会見では、真珠養殖を驚嘆すべき発明と讃えられたことに対し幸吉はエジソンを巨星に例え、自分は数ある発明家の星の一つに過ぎないと返答したと伝えられている。土佐出身の森村市左衛門は1875年（明治8年）に森村組を創設して日米貿易協会長、日本銀行監事などを務め、当時対米貿易の第一人者といわれていた。その組織を通じて輸出市場の調査や販売の拠点作りに協力した人など多くが助力した。
貴族院多額納税者議員

1924年（大正13年）三重県多額納税者として補欠選挙で貴族院議員に互選され、同年12月13日に就任し[2]、公正会に所属して1925年（大正14年）9月28日まで1期在任した[1]。
量産体制

1918年（大正7年）、様々な技術的実証の実験の中から良質な真珠が大量に得られるようになった。翌年にはロンドンの宝石市場にも供給できるようになったが、1921年（大正10年）、ヨーロッパの宝石商が天然真珠と見分けのつかない養殖真珠をニセモノ、つまり詐欺であると断定した騒ぎから訴訟に発展した。御木本側ではイギリスではオックスフォード大学のリスター・ジェームソン、フランスではボルドー大学のH・L・ブータンなどの権威者を証人として正論を述べる等して対抗。イギリスの宝石商は訴訟を取り下げたが、フランスは粘り強く拒否を続けた。1924年（大正13年）5月24日、パリで起こした真珠裁判にて天然と養殖には全く違いが無かったという判決を受け全面勝訴した。