幕府開設当初、初代将軍尊氏は武家の棟梁として諸国の武士を統帥して執事高師直がこれを補佐し、政務・裁判は弟直義が総理する二頭体制が取られた。やがて直義と師直の間に確執が生じ、幕府内が尊氏・直義両派に分裂して観応の擾乱へと発展、南朝方や諸国の武士を巻き込んで内乱は長期化した。

尊氏の後を継いだ2代将軍義詮は幕府機構の再建に努め、病に倒れると、細川頼之を管領に任じて幼少の後継者・義満を後見させた。頼之後見期及び義満による親裁期を経て政治機構が整えられていった。

鎌倉時代の将軍は全国の御家人と個々に主従関係を結び、所領（地頭職）を安堵する立場にあり、守護は任国の軍事・刑事の長であり、国内の御家人の監督者に過ぎなかった。

これに対して室町幕府は、守護大名による合議制・連合政権であったと評される。長期の南北朝内乱の間に、守護はその権限を拡大し、任国内の領主層の武士（国人）を被官化するなどして、任国の管理者から領国支配者（大名）となっていく（ただし地域差があるので、詳細は「守護領国制」を参照）。これにより、御家人＝将軍直臣という鎌倉幕府の基礎構造は失われ、将軍の諸国武士・所領に対する支配は相当後退し、主に守護を通じて全国支配を行う体制となった。しかしながら室町将軍がこの現状をよしとした訳ではなく、鎌倉時代以来の足利氏の根本被官や一族、守護の分家など、守護大名の頭越しに各地の武士と主従関係を結ぶ場合もあった。特に足利義満は直属軍事力の整備に熱心であり、奉公衆を整えていき、以降の将軍にも継承された。

また、義満以降の室町幕府は「天下無為」の実現をもって全国統治の基本的な考え方としていた。「無為」とは何もしないことではなく、何もしない状態にもっていくことを指し、室町殿である将軍の上意をもって紛争当事者間の調停を図るものであった。上意は紛争解決の手段としては万能ではないものの、守護や国人にとっては無視しえないものであった[2]。だが、嘉吉の乱後、幼少の将軍が続いた中で、管領である細川氏と畠山氏が上意を利用して自己に有利な政治的な状況を作りだそうとし、それに振り回された守護や国人は上意に従わなくなり、独自行動を取るようになる。やがて、彼らは仲間同士で連携して行動することで上意の相対化を図るようになり、特に守護たちは細川氏側と反細川氏側（最初は畠山氏、後に山名氏を盟主とする）に分かれて集団を形成して争い、応仁の乱の一因を作った[3]。

その一方で、室町将軍以上の勢威を持った守護大名を幕府が危険視し、討伐した例もある。しかし、個々の守護大名はともかく、守護大名と室町将軍が全面的に対立することはなかった。守護大名は幕府から任命された守護職に支配の正当性の根拠があり、室町将軍の権威を否定することはできず、両者は相互に補完する体制であった（室町幕府―守護体制）。将軍の権威の失墜はすなわち守護大名の権威の失墜を意味し、応仁の乱後にそうなっていくのである。
室町殿御分国

中世後期、天皇から日本国の支配を委任されていた室町殿（征夷大将軍）の政治的権限の及ぶ実効統治範囲、管轄区域のことを室町殿御分国、あるいは室町殿分国、公方分国という。その範囲は九州探題管轄の11ヵ国、鎌倉府管轄の10ヵ国を除いた畿内・近国、山陽道、山陰道、南海道、東海道、北陸道の国々からなる[4]。御分国内の守護家（二十一屋形）の多くは在京し、国政の重要議題は将軍から守護達に諮問され、将軍と共に国政に関わっていた[4]。

文明年間、大和興福寺・別当の尋尊は「大乗院寺社雑事記」に、「就中、天下の事、さらにもって目出度き子細これなし。近国においては、近江・美濃・尾張・遠江・三河・飛騨・能登・加賀・越前・大和・河内、これらはことごとく皆御下知に応ぜず。年貢など一向に進上せざる国共なり。その外は紀州・摂州・越中・和泉、これらは国中乱るゝの間、年貢などの事是非に及ばざる者なり。さて公方御下知の国々は播磨・備前・美作・備中・備後・伊勢・伊賀・淡路・四国などなり、一切御下知に応ぜず。守護の躰たらく、則躰においては御下知畏み入る由申し入れ、遵行などこれをなすといえども、守護代以下在国の者、中々承引能はざる事共なり。よりて日本国は、ことごとく御下知に応ぜざるなり」と記しており、室町殿御分国と日本国の範囲は同一であるとの認識を示している[5]。
地方

室町幕府は辺境分治・遠国融和を基本的な政治方針としていた[6]。15世紀前半に幕府は「遠国事ヲハ少々事雖不如上意候、ヨキ程ニテ被閣」という認識を獲得し[7]、日本国の東側の国境は鎌倉府との境界にある駿河に存在すると理解するようになった[8][9]。こうして地方は幕府による日本国統治の埒外に置かれることになった。
奥羽

東北地方には当初奥州管領が設置されたが、斯波家兼ら4人の管領が並立し争うなど混迷を極め、半世紀を経て奥州探題が設置された。さらに、奥羽2国（陸奥国・出羽国）が鎌倉府の管轄下に組み込まれると廃止されて一時期は稲村公方と篠川公方が設置されている。

幕府は鎌倉府に対抗するため、斯波家兼の孫大崎詮持を奥州探題に補任し、以降大崎氏により世襲される。しかし、蘆名氏・伊達氏などが京都扶持衆として戦国大名化していくにつれて、大崎氏も在地領主化していくことになる。

また、家兼の死後に羽州探題が分裂し次子最上兼頼以降最上氏により世襲される。
関東

観応の擾乱が起こると、足利尊氏は鎌倉に東国10カ国を統括する機関として鎌倉府を設置した。長官は鎌倉公方で尊氏の子足利基氏の子孫が世襲し、関東管領が補佐した。室町時代を通じて鎌倉公方は幕府と対立し、関東管領を務める上杉氏とも対立していった。

これに対抗するため、幕府は東国や陸奥の有力国人を京都扶持衆として直臣化した。このため、足利義教の代に永享の乱を起こした第4代鎌倉公方足利持氏を攻め滅ぼして一時直接統治を図るが失敗に終わり、持氏の子足利成氏を新しい鎌倉公方とした。だが成氏も享徳の乱を起こして、古河御所に逃れて古河公方を名乗り、さらに上杉氏は山内上杉家と扇谷上杉家に分裂したため、応仁の乱が始まる前に関東地方は騒乱状態となる。

幕府も手をこまねいていたわけではなく、8代将軍足利義政の庶兄足利政知を関東に派遣する（堀越公方）。だが、堀越公方も政知の死後に今川氏の重臣伊勢盛時（北条早雲）によって倒されて、失敗に終わった。古河公方も小弓公方との分裂を経て、盛時の子孫である後北条氏によって傀儡化させられていくのである。
九州

九州には本拠を博多（福岡県福岡市）に置く九州探題が設置される。初めは懐良親王ら南朝勢力の討伐に任じられた今川貞世（了俊）が就くが、了俊が九州で独自の勢力を築くと幕府に警戒され、了俊が解任された後は渋川氏の世襲となる。
財政

室町幕府の財政は幕府直轄の御料所からの収入が主であったが、南北朝の戦乱の際に敵対する南朝側より狙われて奪取されたり、自軍への恩賞にされてしまうケースも多く、次第に土地からの収入が減少して鎌倉幕府や江戸幕府に比べて小規模であったと考えられている。このため、武家役として臨時の段銭や棟別銭などが徴収された。

商人に対しては特権や保護の代償に営業税などを取り、各港からの津料、関所のからの関銭（通行税）も徴収された。尚、足利義満の時代に京都の土倉や酒屋に対して恒常的に役銭を取る権利を認められると、段銭や棟別銭等と共に納銭方と呼ばれる幕府御用の土倉によって徴収された。後に納銭方は幕府の委託を受けて税収の保管・出納の事務等も任される様になり、こうした土倉を公方御倉と呼んだ。更に義満が日明貿易を始めると貿易そのものや抽分銭による収益も幕府収入となる。