オープニング映像の初めに、カーク船長を演じるウィリアム・シャトナーが任務の目的を語る。

「Space: the final frontier. These are the voyages of the starship Enterprise. Its five-year mission: to explore strange new worlds, to seek out new life and new civilizations, to boldly go where no man has gone before.」

日本での放映時には以下の意訳がなされ、吹替は若山弦蔵が担っている。

「宇宙、それは人類に残された最後の開拓地である。そこには人類の想像を絶する新しい文明、新しい生命が待ち受けているに違いない。これは人類最初の試みとして5年間の調査飛行に飛び立った、宇宙船U.S.S.エンタープライズ号の驚異に満ちた物語である。」

登場人物
レギュラー

詳細は各個別記事を参照。

ジェームズ・T・カーク（ウィリアム・シャトナー） - 船長（大佐）。地球人男性。

スポック（レナード・ニモイ） - 副長兼科学主任（中佐）。バルカン人と地球人のハーフ、男性。

レナード・マッコイ（デフォレスト・ケリー） - 医療主任（少佐）。地球人男性。

モンゴメリー・スコット（ジェームズ・ドゥーアン） - 機関主任（少佐）。地球人男性。日本語版での呼称はチャーリー。

ウフーラ（ニシェル・ニコルズ） - 通信士官（中尉）。地球人女性。日本語版での呼称はウラ。

ヒカル・スールー（ジョージ・タケイ） - 主任ナビゲーター（大尉）。地球人男性。日本語版での呼称はカトウ（カトー）。

パヴェル・チェコフ（ウォルター・ケーニッグ） - ナビゲーター（少尉）。地球人男性。第2シーズン以降に登場。

カーク

スポック

マッコイ

スコット
（チャーリー）

ウフーラ
（ウラ）

スールー
（カトウ）

チェコフ

準レギュラー

クリスティン・チャペル（英語版）（メイジェル・バレット） - 全シーズンを通して25エピソードに登場。看護師[注 5]。地球人女性。

ジャニス・ランド（英語版）（グレース・リー・ホイットニー（英語版）） - 第1シーズン内の8エピソードに登場。船長付き秘書[注 6]で地球人女性。日本語版での呼称はジェニー。

カイル[22]（ジョン・ウィンストン（英語版）) - 全シーズンを通して11エピソードに登場。主に転送主任を務める地球人男性で階級は中尉。臨時操舵士としてブリッジクルーに加わることもある。

主なゲストキャラクター

以下のキャラクターは後続作品にも度々触れられている。第34話「バルカン星人の秘密」より。トゥプリング第39話「惑星オリオンの侵略」より。サレク（左）スポック（中央）アマンダ（右）

ハリー・マッド（英語版）（ロジャー・C・カーメル） - 第6話「恐怖のビーナス（英語版）」と第37話「不思議の宇宙のアリス（英語版）」に登場。地球人男性で本名はハルコート・フェントン・マッド。小悪党的な人物で宇宙を渡り歩く詐欺師。

クリストファー・パイク（ジェフリー・ハンター / ショーン・ケニー（英語版）） - 第11・12話「タロス星の幻怪人（前後編）（英語版）」に登場。宇宙艦隊の地球人士官で階級は先任大佐。パイロット版におけるU.S.S.エンタープライズの船長でカークの先代にあたる。

カーン・ノニエン・シン（リカルド・モンタルバン） - 第22話「宇宙の帝王（英語版）」に登場する優性人類。20世紀末の地球において、アジアから中東地域を支配した独裁者。

コール（ジョン・コリコス（英語版）） - 第26話「クリンゴン帝国の侵略（英語版）」に登場するクリンゴン人[注 7]の司令官。