創刊当時は、大阪市東区大川町（現・中央区北浜）の現在、住友ビル（住友銀行本店営業部→三井住友銀行大阪本店営業部）が建っている場所にあった五十五番屋敷を拠点とした。

1922年（大正11年）に波江悌夫の設計で大阪市北区堂島に本社社屋を新築し、移転した。毎日新聞社になった後の1956年（昭和31年）、増築部分となる毎日大阪会館北館が完成した。

毎日新聞大阪本社は1992年（平成4年）、北区梅田3丁目の現本社ビルに移転する。旧本社社屋・毎日大阪会館北館は堂島アバンザに建て替えられたが、旧社屋玄関部分がビル正面のオープンスペース内に保存されている。
拠点

近畿・北陸・中国・四国を管轄地域とし、その取材・販売網は毎日新聞大阪本社に引き継がれた。

三重県は中部本社、山口県は西部本社の管轄となっている。ただし、三重県伊賀市と名張市、熊野市、南牟婁郡御浜町・紀宝町は大阪本社の管轄となっている一方、島根県石見地方は西部本社の管轄である。石見地方では2009年までに朝日、読売の発行本社が大阪本社に統一されたが、毎日新聞では現在も出雲地方と隠岐島など東部は大阪本社、石見地方は西部本社の管轄になっている。
主な事業

全国中学校庭球選手権大会 - 1908年（明治41年）創始。1963年にインターハイに組み込まれ、毎日新聞社の事業ではなくなった。

国際オリムピック大会選手予選会 - 1911年（明治44年）に行われ、大毎は最優秀選手に贈られるシルバーカップを寄贈した。

日本フットボール優勝大会 - 1918年（大正7年）創始。

全国高等学校ラグビーフットボール大会

全国高等学校サッカー選手権大会


全国学生相撲選手権大会 - 大阪医科大学学長佐多愛彦の提唱により1919年（大正8年）創始。

全国中等学校相撲大会 - こちらも佐多の提唱により1919年創始。1963年にインターハイに組み込まれ、毎日新聞社の事業ではなくなった。

選抜高等学校野球大会 - 1924年（大正13年）創始。

名人戦 (将棋) - 東日学芸部長阿部眞之助が企画し1935年（昭和10年）創始。大毎も東日の上層という建前上、連名で主催者となっていたが、実際の運営は東日一本で行われた。

本因坊戦 - 1939年（昭和14年）創始。ただし、こちらも大毎は建前上連名で主催者となっていただけで、実際の運営は東日一本で行われた。

著名な在籍人物「毎日新聞社#出身者・関係者」も参照

芥川龍之介 - 1919年（大正8年）入社。作家。

井上靖 - 1936年（昭和11年）入社。学芸部副部長から芥川賞受賞をきっかけに作家に転向。

大山康晴 - 将棋六段だった1942年（昭和17年）に嘱託雇用。後に実力制第三代名人となり通算18期獲得して十五世名人となった。

岡崎高厚 - 1882年、日本立憲政党新聞創刊に参加。

尾張久次 - 1927年入社。印刷工から運動部記者という異例の叩き上げを経て、プロ野球南海ホークス専属スコアラーに転職。

河津祐之 - 1882年、日本立憲政党新聞創刊に参加し第2代主幹。後に司法省・逓信省官僚、東京法学校（現・法政大学）校長。