なお、2023年の大会では、参加料を1選手につき15,000円に設定。ただし、フルマラソンで2時間45分以内の記録を持つ競技者には、参加料の免除措置が講じられている。
競技コース

当大会ではコースが数回にわたって変更されているため、主な期間を対象に、コースの概要や変更点を以下に記載する。
1991 - 2010年大会

コース内の最大高低差は約23mで、2007年世界陸上大阪大会の男子マラソン種目でも使用[注釈 4]。1994年から1996年までの大会では、長居陸上競技場の改修工事期間と重なったため、長居第2陸上競技場をスタート・フィニッシュ地点に設定した[11][† 1]。

長居公園内の長距離走路 - 往路を時計回り・復路を反時計回りに設定。

長居公園の出入口 - 南駐車場付近の出入口を使用。

幹線道路 - 長居公園通・本町通・上町筋・今里筋・中央大通・玉造筋・土佐堀通・御堂筋・勝山通・堺筋・中之島通の一部区間を使用。

折り返し地点 - かつての長堀川を埋め立てた場所（新橋跡）に設置。

大阪城公園付近 - 大坂城の南外濠・西外濠沿いの本町通・上町筋を往復した後に、玉造口 → 雁木坂（高低差約12m） → 京橋口と二の丸を経て、筋鉄門跡から北外曲輪経由で杉山地区を通過するルートを設定。

2011 - 2020年大会

レースの高速化を進めるべく、コースを以下のように変更することによって、最大高低差を23mから9mにとどめた（Google Map）。

長居公園内の長距離走路 - 往路・復路とも時計回りに統一。

長居公園の出入口 - 南西入口を使用。

幹線道路 - 長居公園通・本町通・上町筋を除外する代わりに、あびこ筋・松虫通・城見通を新たに使用。また、今里筋・中央大通の区間を短縮する一方で、玉造筋・土佐堀通・御堂筋の区間を延長した。

折り返し地点 - 道頓堀グリコサインを望む道頓堀川の道頓堀橋に変更。

大阪城公園付近 - 高低差約12mの雁木坂を通過するコースから、大阪ビジネスパーク（弁天島）を通過したうえで、第二寝屋川に架かる弁天橋・新鴫野橋と寝屋川に架かる片町橋・寝屋川橋を渡る平坦なコースに変更。

2021・2022年大会

2021年大会は、新型コロナウイルスへの感染拡大に伴う特例措置として、公道を介さないコース（長居公園内の周回ルート）で開催された（当該項で詳述）。

2022年大会から公道の使用を再開したものの、使用しない間に中之島近辺と御堂筋の道路の形状が変更されたことに伴って、2019年大会までのコースの一部を変更。折り返し点を道頓堀橋より南側（難波交差点の北側）へ移動させたほか、車道が本線（4車線）と側道（2車線）で構成されている御堂筋では、南半分（かつて折り返し点が設けられていた新橋交差点と新たに設けられた難波交差点の間）の走路を本線の中に設定していた。
2023年以降の大会

女子フルマラソン日本記録の更新に向けて後半へのスピードアップを図るべく、長堀通の一部（玉造交差点から上り坂と約1kmの下り坂をはさんで西側の新橋交差点に至る区間）を新たに使用するとともに、中間点を長堀通の上へ移設。また、大阪城公園から玉造筋を玉造交差点まで南下した後に、長堀通内の上記区間を経て新橋交差点から御堂筋を北上するルートを組み込んだ。このような変更に伴って、最大高低差を9mから約18mにまで拡大したほか、大阪城公園内のコースを往路でも復路でも使用するようになった。

その一方で、折り返しのターンに伴う減速を防ぐべく、2022年大会まで御堂筋に設けられていた折り返し点を廃止。御堂筋については、新橋交差点と淀屋橋交差点の間に設けられている側道を、復路に限って使用する。このため、土佐堀通から中之島を経て大阪市役所の北側から御堂筋を折り返し点まで南下するルート（2022年大会までの往路の一部）や、御堂筋のうち新橋交差点より南のエリア（2022年大会まで折り返し点を南端に設置していた区間）をコースから除外した。なお、2023年大会のみ、1994 - 1996年大会と同様の事情から、スタート・フィニッシュ地点を長居第2陸上競技場（ヤンマーフィールド長居）に設定[12][13]。
新型コロナウイルス感染症の流行下での開催
2021年の特例措置

日本国内では、第39回大会（2020年）の前後から新型コロナウイルスへの感染が拡大していることを受けて、日本政府が2020年4月7日に新型インフルエンザ等緊急事態宣言を初めて発出。同月16日から5月14日までは、宣言の範囲を全47都道府県にまで拡大していた。宣言は5月25日付で完全に解除されたものの、この事態を受けて、当大会を主催する日本陸上競技連盟（日本陸連）では「陸上競技活動再開のガイダンス」を2020年6月に策定。（日本陸連が主催する）「競技会開催の条件」として、開催予定の都道府県で緊急事態宣言が解除されていることを明記していた[14]。

日本政府は2021年1月7日から、東京都・神奈川県・千葉県・埼玉県の全域に向けて新型インフルエンザ等緊急事態宣言を改めて発出。2021年の第40回大会開催直前（同年1月13日）には、宣言の対象が大阪府内全域にまで拡大された。これに対して、日本陸連は同月15日付で、「陸上競技活動再開のガイダンス」における「競技会開催の条件」を「宣言の要請内容にスポーツイベントの中止や自粛が含まれていない場合には、感染リスクの軽減策を講じたうえで、競技会の開催を検討できる」と改訂。日本政府では同日の時点でスポーツイベントの中止や自粛まで求めていなかったため、宣言の発出期間中であっても、開催の前日（1月30日）までにこのような要請がない限り第40回大会を開催できるようになった[14]。

第40回大会では当初、第39回大会までと同じく、公道を使用するコース（詳細前述）での開催を予定していた。しかし、感染リスク軽減策の一環で、公道の使用を断念。長居陸上競技場にスタート・フィニッシュ地点の少なくとも一方を残したまま、例年の大会では認めていた一般の観客によるスタンドへの入場を禁止することや、コース沿道での観戦・声援の自粛を求めることなどを条件に、公道を使用しないルートへの変更を関連団体と共に協議した。その結果、同競技場のトラック内にフィニッシュ地点を残す一方で、スタート地点を長居公園内へ改めて設定することを前提に、公園内のランニングコース（1周2.813kmで最大高低差4.4m）を周回ルートとしてコースに組み込む案が浮上[15]。周回ルート約15周（正確には14周と4/5）分と競技場内のトラックを合わせた総延長42.195kmのコースを、第40回大会の特例措置として採用することを開催の10日前（1月21日）に決定した[16][17]。