慶応2年（1866年）、第二次長州征討に反対し、薩摩藩の出兵拒否を行っている。慶応3年（1867年）、雄藩会議の開催を小松や西郷と計画し、四侯会議を開催させる。しかし四侯会議は慶喜によって頓挫させられたため、今までの公武合体路線を改めて武力倒幕路線を指向することとなる。

小松、西郷とともに公議政体派である土佐藩の後藤象二郎、寺村道成、真辺正心（栄三郎）、福岡孝弟、浪人の坂本龍馬、中岡慎太郎との間で将軍職の廃止、新政府の樹立等に関する薩土盟約を三本木の料亭にて結ぶも、思惑の違いから短期間で破棄。

武力による新政府樹立を目指す大久保・西郷・小松は8月14日に長州藩の柏村数馬に武力政変計画を打ち明け、それを機に9月8日に京都において薩摩藩の大久保・西郷と長州藩の広沢真臣・品川弥二郎、広島藩の辻維岳が会し出兵協定である三藩盟約を結んだ。なお、この三藩盟約書草案は大久保の自筆によって書かれたもので、現在も残っている。

10月14日、正親町三条実愛から倒幕の密勅の詔書を引き出した（ただしこの密勅には偽造説もある）大久保は、小松・西郷らと詔書の請書に署名し、倒幕実行の直前まで持ち込むことに成功した。しかし、翌日に土佐藩の建白を受けていた将軍・徳川慶喜が大政奉還を果たしたため、岩倉ら倒幕派公家とともに、王政復古の大号令を計画して実行する。王政復古の後、参与に任命され、小御所会議にて慶喜の辞官納地を主張した。
明治維新後明治4年12月から翌年1月頃（サンフランシスコ）右側は大久保、左側が堺県知事時代の税所篤と思われる。大久保の日記（明治四年五月六日条）に「今日税所子同行写真所等江参」とある。大久保は洋装で、刀を差している。大礼服と軍刀を身に着けた大久保利通1922年、ジョン・ガビンズの日本研究書籍で維新の第一人者として紹介された。

慶応4年（1868年）1月23日、太政官にて大阪への遷都を主張する。

明治2年7月22日（1869年8月29日）に参議に就任し、版籍奉還、廃藩置県などの明治政府の中央集権体制確立を行う。

明治4年（1871年）には大蔵卿に就任し、岩倉使節団の副使として外遊する。

明治6年（1873年）に帰国。外遊中に留守政府で問題になっていた朝鮮出兵を巡る征韓論論争では、西郷隆盛や板垣退助ら征韓派と対立し、明治六年政変にて西郷らを失脚させた。