直鼻猿亜目は、その後、真猿下目とメガネザル下目に分岐する。この分岐の際に、真猿下目のX染色体に位置する錐体視物質に関連した色覚の多型が顕著になり、ヘテロ接合体の2本のX染色体を持つメスに限定した3色型色覚の再獲得につながり、さらに狭鼻下目のオスを含めた種全体の3色型色覚の再獲得へとつながる[14]。
狭鼻下目と広鼻下目の分岐

真猿下目が狭鼻下目（旧世界サル）と広鼻下目（新世界サル）に分岐したのは、3000-4000万年前と言われている[14][15]。脊椎動物の色覚は、網膜の中にどのタイプの錐体細胞を持つかによって決まる。魚類、両生類、爬虫類、鳥類には4タイプの錐体細胞（4色型色覚）を持つものが多い。よってこれらの生物は長波長域から短波長域である近紫外線までを認識できるものと考えられている。一方ほとんどの哺乳類は錐体細胞を2タイプ（2色型色覚）しか持たない。哺乳類の祖先である爬虫類は4タイプ全ての錐体細胞を持っていたが、2億2500万年前には、最初の哺乳類と言われるアデロバシレウスが生息し始め、初期の哺乳類は主に夜行性であったため、色覚は生存に必須ではなかった。結果、4タイプのうち2タイプの錐体細胞を失い、青を中心に感知するS錐体と赤を中心に感知するL錐体の2錐体のみを保有するに至った。これは赤と緑を十分に区別できないいわゆる「赤緑色盲」の状態である。この色覚が哺乳類の子孫に遺伝的に受け継がれることとなった。ヒトを含む旧世界の霊長類（狭鼻下目）の祖先は、約3000万年前、性染色体であるX染色体にL錐体から変異した緑を中心に感知する新たなタイプの錐体（M錐体）視物質の遺伝子が出現し、ヘテロ接合体の2本のX染色体を持つメスのみが3色型色覚を有するようになり、さらにヘテロ接合体のメスにおいて相同組換えによる遺伝子重複の変異を起こして同一のX染色体上に2タイプの錐体視物質の遺伝子が保持されることとなりX染色体を1本しか持たないオスも3色型色覚を有するようになった。これによって、狭鼻下目に第3の錐体細胞が「再生」された。3色型色覚はビタミンCを多く含む色鮮やかな果実等の発見と生存の維持に有利だったと考えられる[16][14]。霊長類の３色型色覚の適応的意義については結論が出ていないのが現状である（上記「果実説」のほか，「若葉説」や「皮膚色説」も存在する。）[17]。

なお、時代を下ってヒトの色覚に鑑みるに、ヒトが属する狭鼻下目のマカクザルに色盲がヒトよりも非常に少ないことを考慮すると、ヒトの祖先が狩猟生活をするようになり3色型色覚の優位性が低くなり、2色型色覚の淘汰圧が下がったと考えられる[16]。色盲の出現頻度は狭鼻下目のカニクイザルで0.4%、チンパンジーで1.7%であり[14]、現生のアフリカ系男性で2-4%、日本人男性で約5%、フランス、北欧系の男性で約10%である[18]。広鼻下目のヨザル属は1色型色覚であり、ホエザル属は狭鼻下目と同様に3色型色覚を再獲得している[14][19]とされている。他方、ホエザルは一様な3色型色覚ではなく、高度な色覚多型であるとの指摘もある[20]。これらのヨザル、ホエザルを除き残りの新世界ザル（広鼻下目）はヘテロ接合体のX染色体を2本持つメスのみが3色型色覚を有し、オスは全て色盲である。これは狭鼻下目のようなX染色体上での相同組換えによる遺伝子重複の変異を起こさなかったためである[14]。ヒトは上記のような初期哺乳類と霊長目狭鼻下目の祖先のX染色体の遺伝子変異を受け継いでいるため、L錐体のみを保持したX染色体に関連する赤緑色盲が伴性劣性遺伝をする。男性ではX染色体の赤緑色盲の遺伝子を受け継いでいると色盲が発現し、女性では2本のX染色体とも赤緑色盲の遺伝子を受け継いでいる場合に赤緑色盲が発現する[21]。なお、日本人では男性の5%、女性の0.2%が先天赤緑色覚異常であるとされる[18]。

3000万年前、漸新世初期に現在の気候が始まると最初の南極の氷が形成され、アフリカと南アジア以外の霊長類は絶滅へ向かった。当時の霊長類の一つが曲鼻猿亜目キツネザル科に近いノタルクタスである。

生き残った熱帯の集団は（それらはカイロの南西ファイユーム低地の後期始新世と初期漸新世の化石層でよく見られる）現生の全霊長類を、すなわち曲鼻猿亜目に属するマダガスカルのキツネザル、東南アジアのロリス、アフリカのガラゴ、そして直鼻猿亜目に属する広鼻猿類（新世界ザル）と狭鼻猿類に属する旧世界ザル、大型類人猿、人類を生み出した。

新世界である南米の広鼻猿類（広鼻下目）は3000万年前から化石記録に現れるが、北アフリカの化石種で彼らの祖先に近縁なものは特定されていない。もしかすると西アフリカで異なる形態で生きていたのかも知れない。西アフリカからは、まだ解明されていない手段で南アメリカ大陸まで、霊長類、齧歯類、ボア、シクリッドが渡っている。洪水などで流されて大西洋経由で漂着したなどの可能性が考えられるも、決定的な説を見いだせていない。これに対して、広鼻下目（新世界サル）の祖先やテンジクネズミ上科の祖先がアフリカでできた浮島に乗って大西洋を流されて新世界の南アメリカ大陸に到着したという説も紹介されている[22]。

既知のもっとも初期の狭鼻猿類は北ケニア地溝帯のEragaleitから見つかっているカモヤピテクス (Kamoyapithecus) で、2400万年前頃生きていたと見られている。その祖先は恐らく、エジプトピテクスかプロピリオピテクス (Propliopithecus) かパラピテクス (parapithecus) の近縁種と見られ、それらは3500万年前のファイユームの地層から見つかっている。その間の1100万年を繋ぐ化石は見つかっていない。
ヒト上科とオナガザル上科の分岐

霊長類の狭鼻下目がヒト上科とオナガザル上科に分岐したのは、3500万年前から3000万年前頃というのがゲノムベースの分析による2000年代前後の定説であったが[23][24]、ミシガン大学の研究チームによる2010年発表の新説では、数百万年若い2800万年前頃から2400万年前頃と推定された[23][24]。ヒト上科（テナガザル、オランウータン、チンパンジー、ゴリラ、ヒト）の共通の祖先が旧世界のサルから分枝した際に、尿酸オキシダーゼ活性が消失したものと推定される[25]。