第一次長州征伐では武備恭順を主張したために9月25日に俗論党（椋梨藤太を参照）に襲われ（袖解橋の変）、瀕死の重傷を負った。ただ、芸妓の中西君尾からもらった鏡を懐にしまっていたため、急所を守ることができ、美濃の浪人で適塾出身の医師の所郁太郎の約50針におよぶ縫合手術を受けて一命を取り留めた。このとき、あまりの重傷に聞多は兄・光遠に介錯を頼んだが、母親が血だらけの聞多をかき抱き兄に対して介錯を思いとどまらせた。このエピソードはのちに第五期国定国語教科書に「母の力」と題して紹介されている。

このときの様子を、『世外井上公傳』は、以下のように記している（182頁）。…口を公の耳に附け、大聲にて、「予は所郁太郎だ。君は家兄に介錯を請うたけれど、母君は是非に治療を受けしめようと自身で君を抱へ、?いて家兄を制止せられた。今現に君を抱へてゐるのは、即ち母君なるぞ。實に非常の負傷だから、予の手術が効を奏するかどうか分からぬが、母君の切なる至情は黙止する譯にはゆかぬ。宜しく予が手術を施すのを甘諾し、多少の苦痛は母君の慈愛心に對して之を忍ばねはならぬ。」と。その言が公の耳底に徹したと見え、頗る感動したやうであった。所は直ちに下げ緒を襷に掛け、焼酎で傷所を洗滌し、小さい畳針を以て縫合し始めた。公は殆ど知覺を失ひ、左程に苦痛を感じなかったやうであったが、それでも右頬から唇に掛けての創口を縫うた時には、苦痛の體であった…

[9]。また、寝込んでいたときに伊藤が見舞いに訪れ、危険だから早く離れろと忠告しても伊藤がなかなか承諾しなかったエピソードものちに伊藤が語っている[10][11][12][13]。体調は回復したが、俗論党の命令で謹慎処分とされ身動きが取れなかった。しかし、高杉晋作らと協調して12月に長府功山寺で決起（功山寺挙兵）、再び藩論を開国攘夷に統一した。

慶応元年（1865年）4月、長州藩の支藩長府藩の領土だった下関を外国に向けて開港しようと高杉・伊藤と結託、領地交換で長州藩領にしようと図ったことが攘夷浪士に非難され、身の危険を感じ当時天領であった別府に逃れ、若松屋旅館の離れの2階に身分を隠して潜伏、別府温泉の古湯楠温泉でしばらく療養した。5月に伊藤からの手紙で長州藩へ戻り、7月から8月にかけて薩摩藩の小松帯刀の斡旋により長崎で外国商人トーマス・ブレーク・グラバーから銃器を購入、そのために薩摩入りを果たした。その返礼として9月8日、毛利敬親父子は島津久光父子に宛てて親書を送り、両藩は実質的に和解した。

翌慶応2年（1866年）1月に坂本龍馬の仲介で京都の小松帯刀邸において薩長同盟が成立、同年6月から8月までの第二次長州征伐で芸州口で戦い江戸幕府軍に勝利した。9月2日、広沢真臣とともに幕府の代表勝海舟と休戦協定を結んだ。

慶応3年（1867年）の王政復古後は、新政府から参与兼外国事務掛に任じられ九州鎮撫総督澤宣嘉の参謀となり、長崎へ赴任。浦上四番崩れに関わったあと、翌明治元年（1868年）6月に長崎府判事に就任し長崎製鉄所御用掛となり、銃の製作事業や鉄橋建設事業に従事した。明治2年6月に政府の意向で大阪へ赴任、7月に造幣局知事へ異動となり（8月に造幣頭と改名）、明治2年から3年（1869年 - 1870年）にかけて発生した長州の奇兵隊脱隊騒動を鎮圧した。この間、明治2年11月に死去した兄の家督を継承、甥で兄の次男勝之助を養子に引き取り、明治3年8月に大隈重信の仲介で新田俊純の娘・武子と結婚している[14][15][16][17]。
留守政府時代造幣局時代の井上馨（右端）。その左に大隈重信（横浜外務事務局）、伊藤博文（神戸外務事務局）。後列右より中井弘、久世治作（ともに造幣局）1880年（明治13年）

明治維新後は木戸孝允の引き立てで大蔵省に入り、伊藤と行動を共にし、主に財政に力を入れた。

明治4年（1871年）7月に廃藩置県の秘密会議に出席し、同月に副大臣相当職の大蔵大輔に昇進。大蔵卿・大久保利通が木戸や伊藤らと岩倉使節団に加わり外遊中は留守政府を預かり、事実上大蔵省の長官として「今清盛」と呼ばれるほどの権勢をふるう。

しかし大蔵省は民部省と合併してできた巨大省庁で、財政だけでなく地方官僚を通して地方行政にも介入できたため（元幕臣中野梧一の山口県参事登用など）、予算問題で改革にかかる多額の予算を要求する各省と衝突しただけでなく、学制頒布を掲げる文部卿・大木喬任や地方の裁判所設置と司法権の独立を目指す司法卿・江藤新平との対立も発生した。また、行政府の右院は各省の長官が構成員であり、前述の関係上対立・機能不全は避けられず、立法府の左院と最高機関である正院も調整力が疑問視されていた。

こうした事態を憂いた井上は大久保の洋行に反対だったが、西郷隆盛が大久保の代理となることで納得した。しかし、秩禄処分による武士への補填として吉田清成に命じたアメリカからの外債募集はうまくいかず、明治4年9月に大久保とともに建議した田畑永代売買禁止令・地租改正もまだ実現できず、財政は窮乏していた。

緊縮財政の方針と予算制度確立を図ったが、文部省が学制頒布、司法省が司法改革などで高い定額を要求すると拒絶して予算を削ったことが江藤らの怒りを買い、明治6年（1873年）、江藤らに予算問題や尾去沢銅山汚職事件を追及されて5月に辞職した。そのときに渋沢栄一と連名で建議書を提出し、政府の財政感覚の乏しさを指摘した。その建議書は新聞雑誌に掲載され、国家予算の明朗化の第一歩となった[18]。その後、9月に使節団が帰国、征韓論をめぐる政争や10月の明治六年政変で西郷、江藤、板垣退助らが下野、大蔵省の権限分譲案として内務省が創設される。また、翌明治7年（1874年）に江藤が佐賀の乱を起こして敗死するなど変遷があったが、すでに下野していた井上にはそれらに関わりがなかった[19][20][21][22]。
外交と条約改正に尽力

政界から引いたあと、一時は三井組を背景に先収会社（三井物産の前身）を設立するなどして実業界にあったが、伊藤の強い要請のもと復帰し、辞任していた木戸と板垣の説得にあたり、伊藤に説得された大久保との間を周旋し両者の会見にこぎつけ、明治8年（1875年）の大阪会議を実現させた。同年に発生した江華島事件の処理として、翌明治9年（1876年）に正使の黒田清隆とともに副使として渡海、朝鮮の交渉にあたり2月に日朝修好条規を締結した。6月、欧米経済を学ぶ目的で妻武子と養女末子、日下義雄らとともにアメリカへ渡り、イギリス・ドイツ・フランスなどを外遊。中上川彦次郎、青木周蔵などと交流を結んだが、旅行中に木戸の死、西南戦争の勃発や大久保の暗殺などで日本が政情不安になっていることを伊藤から伝えられ、明治11年（1878年）6月にイギリスを発ち、7月に帰国した。