2月2日、普請が「石蔵積み」から始められ、畿内のみならず、その近国の武士も参加して進められた[12]。その数は8万人余に及んだという[14]。この城の石垣には、京都中から集められた墓石や石仏も使われた。山科言継は石蔵に驚嘆しており[8]、この御所が初めて本格的に石垣を積んだ城であったことを示している。

信長自身が普請総奉行として現地で陣頭指揮を執り、3ヶ月の間在京し、奉行として普請にあたった[12]。御殿などの建築を統括する大工奉行には村井貞勝と島田秀満が任じられた。

建物の多くは本圀寺から移築され[15]、さらには屏風や絵画などの什器までも本圀寺から運び込まれた。宣教師ルイス・フロイスの『日本史』では、信長が木造建築の宮殿の造営を決心したものの、新たに山や森を伐採せねばならず、工事が遅延することを恐れ、本圀寺から「きわめて巧妙に造られた塗金の屏風とともに」「すべての豪華な部屋を取り壊し、城の中で再建すること命じた」と記されている[16]。『当代記』や『 老人雑話』にも、同様のことが記されている[17]。

3月3日、細川氏一族で分家・細川典厩家の細川藤賢邸から、文字通り「鳴り物入り」で名石「藤戸石」が御所の庭園に置くために搬入された。『言継卿記』3月3日条には、「細川右馬頭庭の藤戸石、織田弾正三四千人でこれを引く、笛鼓似てこれを囃す」と記されている[18]。このことから、信長が率先して御所の普請にあたっていたことがわかる[19]。

築城は約70日という短期間で終え、4月14日に義昭は完成した二条御所に移動し、ここに本拠とした[16]。周辺からは金箔瓦も発掘されており、急ごしらえにしては豪壮な殿舎であったと考えられている。また、『言継卿記』では、室町通り沿いの「西方石蔵」は高さ「四間一尺」（約8m余）と記されており、壮観な光景であったと考えられている[8]。

完成した御所の四周は、「東西の範囲は室町通りと東洞院通り」「北は出水通り（近衛大路）、南は丸太町通り（春日小路）」と現在では考えられている[17]。このうち、西側は室町通りであった考えられる[17]。そのため、義昭の御所はとても巨大なものであった[8]。

元亀3年（1572年）3月、信長は義昭の強い勧めもあってこの城の北方、武者小路辺に自らの屋敷を着工している（未完成）。建築物を奪われることに困った本圀寺の僧侶らは松永久秀に、信長への移築中止の取り成しを頼んだが無理だと断られた。また、1500人の法華信徒らが莫大な品を信長に献上し、さらに望み通りの金銭の提供も申し出て免除を請い、将軍や朝廷にも働きかけたが、信長は取り合わなかった[20]。

ところが、義昭と信長の関係は徐々に悪化し、元亀3年に義昭の信長追討令に応じた武田信玄が西上を開始し、三方ヶ原の戦いで勝利を収めた。そして、義昭はそれを知ると、信長からの離反を決意した。

天正元年（1573年）2月、義昭は二条御所において、信長に対し挙兵した。

3月、信長が入洛したが、義昭は二条御所に数千の兵とともに籠城し続けた（二条御所の戦い）。

4月、信長は上京の町屋を焼き払い（上京焼き討ち）、二条御所を包囲し、義昭に圧力をかけた。だが、御所自体に対しては攻撃を控え、正親町天皇の勅命を得て、和議が成立する。

7月3日、義昭は再び、宇治の槇島城において挙兵した。この時、二条御所には公家の日野輝資と高倉永相、義昭の側近で幕臣である三淵藤英と伊勢貞興が守備のため置かれたが、織田軍に包囲されると、12日に降伏した[21]。

信長は義昭が去った御所を占拠し、御所内の殿舎を破却した[22]。その際、諸人によって御所内が略奪されるのを禁じなかった[22]。

7月18日、槙島城の義昭も降伏し、畿内から追放され、室町幕府は実質的に滅ぶことになった（槇島城の戦い）。