「第3新東京市」に来襲する謎の敵。形状や能力はそれぞれ異なるが、必ず「コア」と呼ばれる部位があり（通常は赤色の球体）、それを破壊されると活動を停止。新劇場版では、その際に全身が血のような液体に変化する（形象崩壊）。A.T.フィールドを持ち、エヴァンゲリオン以外の通常兵器はほとんど意味をなさない。また、新劇場版では全ての使徒において「天使の輪」（エンジェルハイロゥ）のようなものが現れるシーンがある。

出現順に、番号を冠して呼ばれる。作中のNERV本部の画面や、ゲンドウ、マヤ、加持の台詞では「第○使徒」と、ポスターや、作中での冬月の台詞および加持の台詞の日本語字幕では「第○の使徒」とされる。前作『序』の第6使徒出現時にゲンドウが「残り8体の使徒を倒さねばならない」と発言しているが、その場面の時点で未殲滅である第3の使徒と第6の使徒、『Q』終了現在新劇場版未登場の第11の使徒、そして本来なら存在することのないはずの第13の使徒を数に入れているのか不明である。
第2の使徒「リリス」
NERV本部の地下深く（レベルEEE）にあり、十字架に磔にされ槍で刺されている人型の使徒。これと他の使徒が接触することでサードインパクトが引き起こされるとされ、レベルEEEまで使徒が侵入した場合、本部ごと自爆してそれを阻止することになっている。本作品では1カットのみ登場するが、物語への直接的な絡みはない。
第3の使徒
永久凍土から発掘され、NERV・ユーロ支部の旧北極基地「ベタニアベース」で解剖、封印されていた使徒[8]。骸骨状の竜（あるいは蛇）のような首と尾が生えており、頭部にコアがある。胴体は丸く縛られ、頭部にはゼーレの刻印が押されている。首の部分に、エントリープラグソケットが埋め込まれている[13]。歩行に用いる4本の短い脚のほか、太い4本の脚（特に使われない）をもつ。加持によって封印が無効化され活動再開、「辺獄エリア」を突破し地上の「アケロン」へ脱出するが、それを追うエヴァ仮設5号機のマジックハンドでコアを破壊、殲滅された（直後に仮設5号機も自爆）。デザインは主に鬼頭莫宏による[14]。
第7の使徒
相模湾沖に出現した使徒。コンセプトは「水飲み鳥」[8]。頂上部に時計を模したような顔があり、そこからシンメトリックなオブジェのような身体と2本の非常に細長い脚をもつ。登場時、上部にあるコアらしきものはデコイ（囮）であり[8]、真のコアは下部の球体内部にある。足先で海水を凍らせてその上を歩行する[8]。無数の触手を伸ばしてエヴァ2号機に攻撃をかけるが全てかいくぐられる。デコイ（囮）のコアを破壊されると一度身体が崩れるが、すぐに復活。しかし球体内部にある真のコアを蹴り砕かれて形象崩壊した。テレビ版第八話の原画が紛失していたためシナリオごと新たに製作された[14]。デザインはコヤマシゲトと小松田大全による[14]。