ロンドンに住む紳士・フォークナー卿は仕事場からその一枚絵を持ち出すが、誰かと待ち合わせていたところをスコットランドヤードに取り押さえられる。そこに現れたロンドンの名探偵の名を継承する諮問探偵シャーロック・ホームズは、そのフォークナー卿はアルベール・ダンドレジーの変装した偽物であることを看破する。MI6まで現れ追い詰められたアルベールは自決を図るも旧知の仲であるルパン三世に助けられ、彼に例の一枚絵を持ち去られる。ルパン一味も一枚絵を狙っていたのだ。

14歳の少女リリー・ワトソンと暮らすホームズは、10年前に起きた事件を機に探偵として一線を引いていたが、一枚絵を持ち出したことで追いかけられるルパンに遭遇。ルパンを目の当たりにしたリリーは気を失い、ホームズはルパン一味に挑戦する。

一枚絵にはどんな秘密が隠されているのか?10年前に一体何が起こったのか?そしてルパンとホームズの因縁とは?
第2クール

レイブンの秘宝を巡る事件からしばらくして。ニューヨークのマンションでゴロゴロ過ごしていたルパンはある時、不二子からの紹介で盗品オークションに出品されるお宝の数々を聞かされる事になるが、その中の一つである赤く輝く宝石を見たルパンは、目の色を変えるかの様な表情を見せる。

次元や不二子は赤い宝石を見てからのルパンの様子がおかしい事に気付くが、実はその赤い宝石は、子供の頃のルパンが過ごしていた屋敷に保管され、ある「女」によって盗まれたお宝の一つであり、ルパンは何が何でも取り戻そうとする。老人に変装したルパンはオークションの行われる場所を下見するが、そこに飾られている花に興味を惹かれた事で、花の展示を行った花屋で働く少女マティア・ファーラーと関りを持つ事になる。一方、いくら調査しても赤い宝石の出品者は突き止められず、出品者の正体を知るには宝石を盗むしかないと判断したルパンは、オークション会場の襲撃計画を立てる。

オークション当日、警官に変装したルパン、次元、五ェ門の三人は、徹底した厳重な警備の敷かれているオークション会場の外に待機。あらかじめ仕組んでいた超小型の虫型のドローンを用いたトリックによってオークション会場を混乱させ、その隙に本物の警察官達を扇動しオークション会場へ乗り込むが、そこへ謎の赤毛の女・メルセデス率いる女強盗団「エルヴィラ」が襲撃。テロも同然の容赦無いやり方を行使するエルヴィラによって、ルパンの狙っていた宝石を始めとする出品されたお宝は全て奪われ、ルパンは変装を解いてメルセデスの追跡を行う。その光景をICPOの若手女性捜査官であるアリアンナが目撃するが、なぜか彼女は警察官達にルパンの追跡を指示しようとしなかった。

ルパンとエルヴィラの戦いを映像や街中、窓から様々な「女」達が感情の無いかの様な冷たい目で見る中、宝石を持ったメルセデスを追い詰めようとするルパンであったが、メルセデスと思われていたのは彼女の影武者で、その影武者を平然と巻き添えにして殺す形でメルセデスはルパンに攻撃。吹き飛ばされた宝石に手を伸ばそうとするルパンであったが、眼下に花屋の仕事をしていたマティアがいた事に気付き、彼女が瓦礫の下敷きになりそうだった事から、ルパンは宝石を諦めてマティアの救出を優先する。

瓦礫の破片で頭部を負傷したマティアを介抱する中、宝石を手に入れて勝ち誇ったメルセデスが現れ、「ルパン三世、アンタの時代は終わったよ。トモエに教えを乞うた割にはガッカリだね…」と、ルパンを心底侮蔑する言葉を言い放って去っていく。駆け付けた次元達から「トモエ」と呼ばれた女性について心当たりがあるのかと問われたルパンは、その女性が自分の「母親」である事を告げるのだった…。

果たしてエルヴィラを率いるメルセデスの目的は？そしてルパンとエルヴィラの戦いを見ていた「女」達は一体何を思っているのか？
登場人物
メインキャラクター
ルパン三世
声 - 栗田貫一[1][11]アルセーヌ・ルパンを祖父に持つ神出鬼没の大泥棒である主人公。第0話のみ『TV第4シリーズ』『TV第5シリーズ』で着ていた青のジャケット&濃いピンクのネクタイだったがそのラスト以降から『TV第1シリーズ』『カリオストロの城』『風魔一族の陰謀』で着用した緑のジャケット&黄色のネクタイに着替えた[注 4]。第1クールでは次回予告を行う。第2クールにおいて、幼少期にトモエから盗みの技術を教わっており、この時同時に催眠にかけられかけるも失敗していた、という過去があきらかになる。またこの時催眠にかけるためのキーワードを植え付けられており、移動先の様々な女性からキーワードを一文ずつ話されることで催眠にかかり、トモエの元へ向かっていった。なお、催眠自体はトモエの元へ向かう途中で一味の仲間のことを思い出して解けており、一味の仲間と共に芝居を行うことでトモエに近づき、最後はトモエを射殺した。
次元大介
声 - 小林清志（第0話）[7][8]、大塚明夫（第1話以降）[8][11]お馴染みのルパンの相棒で凄腕の早撃ちガンマン。
石川五ェ門
声 - 浪川大輔[11]斬鉄剣を愛用する居合い斬りの達人。
峰不二子
声 - 沢城みゆき[11]自他共に認める自分の欲望に忠実な女盗賊。第2クールでは（出番がない回も含め）次回予告を行う。
銭形警部
声 - 山寺宏一[11]ルパンの永遠のライバルである敏腕警部でICPOに出向しているルパン専任捜査官。アニメ作品としての前作にあたる『プリズン・オブ・ザ・パスト』に続いて、本作でも銭形警部専用車として2代目日産・ブルーバードの日本仕様パトカーを乗り回している[注 5]。
過去作から登場するキャラクター
八咫烏五郎
声 - 島崎信長[11]『TV第5シリーズ』でレギュラーキャラクターとして初登場し、本作でも準レギュラーキャラクターとして登場。ICPOに所属する銭形の部下。
アルベール・ダンドレジー
声 - 津田健次郎[11]『TV第5シリーズ』でレギュラーキャラクターとして初登場し、本作では第1クールにてゲストとして登場。アルセーヌ・ルパンの末裔の1人で、ルパン三世とは旧知かつ因縁の相手。表向きの顔はフランス司法警察中央局長。ロンドンに潜入してフォークナーに変装し、秘密組織「レイブン」のお宝に繋がる絵を盗むが、ホームズの介入によってスコットランドヤードとMI6に追われる羽目になり、負傷して追い詰められたところをルパンに救出される。その後は迎えに来た部下の手引きでフランスに戻り病院で療養している。
今作オリジナルキャラクター
第1クール
シャーロック・ホームズ
声 - 小原雅人[11]ロンドンを拠点に活動し、諮問探偵[注 6]と呼ばれる中年の紳士。推理力はその名に恥じず[注 7]、ルパン一味とも互角に渡り合える程の格闘や射撃の腕を持ち、バイクのテクニックにも秀でている。スコットランドヤードと協力して数々の大事件を解決してきたが、10年前に関与した事件で相棒だったワトソンを喪い、それを機に探偵としては一線を退いた（この事件にルパンも居合わせており因縁が生じた）。ワトソンの娘リリーを引き取って以降は彼女の保護を最優先とする暮らしに切り替え、浮気調査やペット探しといった小さな仕事を主に請け負っている。その分市井での評判は良く、町の人々と親密に交流し互いに助け合っている。ルパン三世と同様に、先人の名跡を受け継いだ人物とされている。ルパン三世と異なり現在のホームズが何代目か、どのような基準で襲名を許されるかといったことは明らかにされていない。
リリー・ワトソン
声 - 諸星すみれ[11]本作の第1クールのゲストヒロイン。ホームズと同居する14歳の少女。普段は学校に通っており、ホームズを助けるために事件のネタを拾ってくるなど度々奔走している。10年前の事件によって父親を失っている。リリーは犯人の顔を目撃していたが、父親を失ったショックで事件に関する記憶を失っており、彼女の記憶が本作の重要な要素となっている。本編では時間経過とともに徐々に記憶が戻りつつあり、事件現場にいたルパンを目撃したことでそれが加速する。
レストレード
声 - 志村知幸スコットランドヤードに所属する警部。ホームズとは親しい仲で、捜査中の事件の調査を依頼することもある。普段は穏やかな性格だが、MI6の秘密主義には頭を悩ませている。ルパン三世の出現を受け、ロンドンへ渡ってきた銭形と手を組む。12話にてリリーの父親・ワトソンを殺害した犯人であり、レイブンの一員であることが判明する。記憶の戻った真実を明かされてレイブンの財宝を手に入れようと体に爆弾を巻き付けてルパンたちを脅すも、宝は使い物にならない不発弾ということが分かり、そんな物の為にワトソンを殺害したことにショックを受ける。そしてリリーへの謝罪の言葉を口にして橋から身を投げ爆発する最期をとげる。
ハドソン
声 - 園崎未恵ホームズとリリーの住むアパートの女主人。
ジョン・H・ワトソン
声 - 西村太佑故人。ホームズの過去の相棒で、リリーの父。
セバスチャン・モラン大佐
声 - 金尾哲夫傭兵上がりの凄腕の狙撃手。特殊な空気銃を武器とする。「教授」と呼ばれる人物に雇われホームズを狙う。