1444年まではシュトラースブルクに住んでいた。1440年、シュトラースブルクで自身の研究に基づく印刷術を完成させ、 Kunst und Aventur（アートと事業）と題してその秘密を公開したと言われている。彼がどういうことをやっていたのか、既に活字を使った印刷を試していたのかは定かではない。その後、記録には4年間の空白がある。1448年、マインツに戻ると義理の兄から借金しており、印刷機などの機器をそろえる資金にしたと見られる。そのころまでに凹版印刷に精通していた可能性がある。トランプ・カードの画家（英語版）と呼ばれる銅版画家と仕事をしていたという説もある[18]。
1450年までには印刷所の運営を開始しており、最初に印刷したのはドイツ語の詩と見られている[19]。グーテンベルクはヨハン・フスト（英語版）なる裕福な金貸しから事業資金を得ることに成功した。フストは設備費として800グルデンを貸し付け、二人は共同事業者として新規事業を立ち上げた。またその頃フストがペーター・シェッファー（英語版）（1430年頃-1467年）という青年をグーテンベルクのもとに連れてきた。シェッファーはパリで写字生の経験があり、いくつかの最初の書体をデザインしたと考えられている。シェッファーは後にフストの娘クリスティーナと結婚して婿になり、印刷業をビジネスとして成功させることになる。
グーテンベルクは遠い親戚が所有する Hof Humbrecht と呼ばれる建物を印刷所とした。この頃、自宅附属の印刷所だけでなく、フストの資金で設立した新しい印刷所の二ヶ所で印刷を行っていたことがわかっている（このことを明らかにしたのは19世紀の研究者カール・ジアツコ (Karl Dziatzko) である）。彼がいつ聖書の印刷を企図したのかは不明だが、そのためにフストからさらに800グルデンを借り、1452年からその仕事を開始した。同時に他のより儲かる印刷物（ラテン語の文法書など）も印刷した。聖書用とそれ以外用の2つの印刷機があったという推測もされている。最も利益の上がった印刷は、教会向けの数千枚の贖宥状の印刷で、1454年から1455年ごろから印刷している[要出典]。
後に「グーテンベルク聖書」と呼ばれる最初の印刷聖書「四十二行聖書」は1455年に完成した。約180部を印刷し、多くは紙だが、一部は羊皮紙に印刷された。 これと前後してフストがグーテンベルクを訴えるという事態が起きた。ゲッティンゲン大学に保管されている『ヘルマスペルガー文書』によるとフストは以下のように主張している。すなわち、フストがグーテンベルクに聖書の印刷事業に必要な設備投資のために二回にわけて1,600グルデンの資金を貸与したが、グーテンベルクは別の用途に使った上に返済の意志がないため、貸与金額に利子をつけて2,026グルデンの返済を要求するというものであった。裁判所はフストの訴えを認め、グーテンベルクに借金の返済を命じた。しかしグーテンベルクは十分な所持金を持っていなかったため、グーテンベルクの印刷機と活字、印刷済みの聖書の半分などがすべて抵当としてフストの手に渡った。 グーテンベルクはこの決定にも落胆することなく、再び資金を集めて自宅の印刷所で書籍の印刷を続け、1459年頃にはバンベルクのアルブレヒト・プフィスター
訴訟
一方でグーテンベルクを追い出す形になったフストとシェッファーは事業を順調に発展させ、1457年8月15日に出版した『マインツ詩篇（英語版）』は世界で初めて奥付（コロフォン）に印刷日と印刷者名（フストとシェッファー）を入れた書籍として歴史に残ることになる。グーテンベルクの名はどこにも記されていない。 1462年、マインツは対立する司教同士の争いに巻き込まれた。一方のアドルフ2世大司教に従う軍勢がマインツを略奪し、グーテンベルクは自宅と印刷所を失った。既に老齢となっていたグーテンベルクはエルトフィレ・アム・ラインに逃れた。 すべてを失ったかに見えたグーテンベルクであったが、印刷術考案の功績を讃えて1465年にアドルフ大司教の宮廷に従者として召し抱えられる栄誉を得た。俸給として宮廷での衣装一式と、2,180リットルの穀物と2,000リットルの免税のワインを与えられている。 グーテンベルクがひっそりと世を去ったのは3年後の1468年のことであった。没年齢は70歳頃と考えられる。マインツの教会に埋葬されたが、その教会と墓地は後に破壊されており、グーテンベルクの墓は現存しない。 1504年、マインツ大学教授 Ivo Wittig がマインツにグーテンベルクの石碑を建てた。肖像画が描かれたのは1567年が最初で（Heinrich Pantaleon が書いたドイツの偉人伝）、ほぼ想像に基づいている。 1450年から1455年までの間にグーテンベルクはいくつかの文書を印刷しており、未確認のものもあるとされている。彼は印刷者名や日付を記さなかったため、印刷物の中身と外部の記録から特定するしかない。マインツでそのころに発行されたとみられる教皇の書簡や贖宥状が存在する。贖宥状は大量に印刷され、2種類のものが7版、全部で数千枚が印刷されている[20]。アエリウス・ドナトゥスのラテン語文法書はグーテンベルクが印刷したものもあるとされている。それらは1451年から52年、あるいは1455年に出版されたと見られている。 1455年、フストとグーテンベルクは各頁42行で二巻本のラテン語聖書 (Biblia Sacra) を完成させた。1巻30フローリンで売られ[21]、その価格は当時の平均的事務員の3年分の給料に相当する。それでも写本に比べれば安価であり、写本が一冊を作るのに一年近くかかることを考えれば大量生産につながる画期的な事業といえた。ただし、この聖書では本文の印刷後に手書きの聖書と同様の手法で装飾を手で書き加えている。 1455年に印刷された『グーテンベルク聖書』（行組から『四十二行聖書』と呼ばれる）は完全な形で世界に48セット残っており、ドイツ、イギリス、アメリカ合衆国などに保管されている。大英図書館には2冊あり、オンラインで閲覧・比較可能になっている[22]。
晩年
グーテンベルクの印刷物詳細は「グーテンベルク聖書」を参照四十二行聖書の冒頭、ヒエロニムスの書簡
