1519年、神聖ローマ皇帝マクシミリアン1世が崩御すると、教皇レオ10世らの支持を得てフランソワ1世もローマ皇帝位の後継者候補になるが1票も獲得出来ず、スペイン王カルロス1世（マクシミリアン1世の孫）が皇帝選挙に勝利し、カール5世として即位する[14]。これにより、フランスはハプスブルク家によってドイツ・スペインと周囲を囲まれてしまう状況が固定化した。

1521年から1544年にかけては、イタリアを巡ってカール5世と争い、1525年のパヴィアの戦いでは前線で指揮を取るが、捕虜となってしまう[15][16]。スペインで幽閉されていた間の1526年にカール5世とマドリード条約を結ぶが[17]、解放されるや条約は無効と宣言し[18]、教皇クレメンス7世もこれを支持した。

カール5世に対抗するため、コニャック同盟で教皇、イングランド王ヘンリー8世らと結び、ドイツのプロテスタント諸侯（ルター派）を支援したり、異教徒であるオスマン帝国のスレイマン1世と秘かに結びつき[19]、第一次ウィーン包囲をけしかけたりもしている。フランソワ1世自身はカトリックであり、檄文事件をきっかけに国内のプロテスタントを弾圧している[20]。しかし、ローマ略奪で教皇はカール5世と和睦、他のイタリア諸国もカール5世に従属し、1529年にフランスがイタリア放棄を約束したカンブレーの和約を締結した[21]。

和平の一環として、1530年にカール5世の姉でポルトガル王マヌエル1世の未亡人であったレオノール（エレオノール）と2度目の結婚をしている[22]。しかし、以後もカール5世との戦闘を継続、ドイツのプロテスタント諸侯が結成したシュマルカルデン同盟と同盟を結んで戦ったもののハプスブルク家の優勢を覆せず、最終的に1544年にクレピーの和約（fr）を結び、イタリア政策は失敗に終わった[23]。1547年3月31日にランブイエで死去[24]、長男フランソワに先立たれていたため、次男アンリがアンリ2世として即位、イタリア戦争を再開した。

フランソワ1世はアメリゴ・ヴェスプッチのスポンサーとしてその航海を援助した。新大陸の中南米を押さえたカール5世に対抗し北米を狙ったためである。またジャック・カルティエをカナダ植民に送り出し[25]、ヌーベルフランス（フランス領カナダ、現在のケベック州）の基礎を築いている。

また、芸術の後援者であったフランソワ1世は、名画『モナ・リザ』を携えたレオナルド・ダ・ヴィンチを含む多くのイタリア人芸術家の支援を行い、結果的にフランスのルネッサンスを推進させた。