本作では恐竜の「ヨッシー」が初登場した。特定のブロックを叩くと卵が出現し、すぐに割れて出現する。出現したヨッシーに騎乗して進むことができる。途中で降りることもできる。ただし、お化け屋敷・砦・城では同伴できない[注釈 4]。

騎乗状態で敵を踏みつけた時はスピンジャンプと同様の効果となる。騎乗状態でブラックパックンの上に乗ったときはダメージを受けることなくそのまま移動できる。

長い舌を出して敵キャラクターやアイテムを口に含むことができる。果物を食べたり敵キャラクターを飲み込んで倒したりするとコインが1枚増える。飲み込んだものが甲羅やアイテムの場合は一定時間ヨッシーの口の中に保持され、しばらくすると飲み込むが、飲み込む前に吐き出すこともできる。ただし1UPキノコやスーパーキノコなどのパワーアップアイテムを飲み込んだ場合、通常と同様にマリオ（ルイージ）に対して効力を発揮し、コイン枚数には計上されない。

赤・青・黄の甲羅を口に含んでいる時は、甲羅の色によりそれぞれ次の特殊能力が備わる。

赤 - 吐き出すことで、正面と前方斜め上下の3方向にファイアを放つ。ファイアに当たった敵はコインに変わる。

青 - ジャンプボタンを押し続けることで空を飛べる。

黄 - ジャンプ後に着地した際に、衝撃で周囲の敵を倒せる。

なお、黄が変化して出現する「無敵ノコノコ」の甲羅を口に含むと、上記3種類の能力を全て同時に使用できる。

騎乗時にダメージを受けるとヨッシーはマリオから逃げていくが、追いかけて再度騎乗することができる。ジャンプ中にヨッシーから降りることで、2段ジャンプも可能。

通常の緑色のヨッシーのほか、赤・黄・青色をした「伝説のヨッシー」といわれるヨッシーも存在する。伝説のヨッシーは子供の状態で出現し、抱きかかえて持ち歩くことができる。この状態で敵キャラクターに正面から接触し、5体の敵、もしくはアイテムを1個を食べさせると成体になる。これらのヨッシーに騎乗している時は、どの色の甲羅を口に含んでも、ヨッシーの身体の色と同色の甲羅の効果が重複して現れる。例えば青ヨッシーが赤い甲羅を口に含んでも空を飛ぶことが可能で、かつ吐き出すとファイアになる。
2人プレイ

2人プレイ時には過去シリーズと同様に1Pがマリオ、2Pがルイージとなり、交代しながらゲームを進める。今作では、片方のプレイヤーがミスした時やコースクリアした時に加えて、一度クリアしたコースでポーズをして途中で抜け出した時でも交代になる。

今作ではマップのシステムが変更されたため、一方があるワールドを攻略している間にもう一方が別のワールドを攻略していくことも可能となった。また、コントローラーを本体に1つだけ接続している場合、同じコントローラーでマリオとルイージを交互に操作することができる。

操作するキャラクターの残り人数が0になるとゲームオーバーとなる。

今作ではマップ画面でマリオとルイージの間で残り人数の受け渡しが可能となった。一方がゲームオーバーした際にも、もう一方から受け取ることで復帰できる。

なお、前作にあったバトルゲームは廃止された。
セーブ機能

今作ではバッテリーバックアップ機能が搭載されており、進行状況をセーブできる。セーブはお化け屋敷・スイッチの宮殿・城・砦・ラムネ海溝の沈没船をクリアしたときに行うことができる。ただし、マリオの状態や残り人数などは記録されず、再開する場合は必ず残り人数5人、通常のマリオ（ルイージ）、得点・コイン枚数ゼロの状態からスタートする。
アイテム
変身アイテム
スーパーキノコ
取るとスーパーマリオ（ルイージ）になる。スピンジャンプでクルクルブロックを壊せるようになる。ダメージを受けると通常のマリオ（ルイージ）状態に戻る。これをファイアマリオ（ルイージ）やマントマリオ（ルイージ）の時に取るとそのままアイテムストックに送られるが、アイテムストックにファイアフラワーやマント羽根が既に入っていると上書きされる。
ファイアフラワー
取るとファイアマリオ（ルイージ）になる。ファイアボールを前方に投げて敵を攻撃できる。今作ではファイアボールが当たった敵はコインに変わるようになっており、そのコインを取ることでコイン枚数が増える。スピンジャンプをすると自動的にファイアボールを前後に撒き散らす。
マント羽根
取るとマントマリオ（ルイージ）になる。ダッシュして飛ぶと両手を広げて斜め前方へ上昇飛行し、上昇の頂点に達した際に方向キーの前方を押し続けると急降下する。滑空中に進行方向と反対側に方向キーの横を入力するとムササビのようにマントを広げて再び上昇し、これをテンポよく繰り返すことで長時間滑空し続ける事が可能。飛行中に急降下して地面に激突すると地震を起こし、近くにいる地上の敵を一気に倒せる。飛行中に敵にぶつかっても飛行がキャンセルされるだけでダメージは受けない。また、滑空していない状態でマントを振ることで敵への攻撃や仕掛けの作動にも使用可能。スピンジャンプをするとマントを振った状態になり、マントの攻撃判定が現れる。
パワーバルーン
表面に「P」と書かれた風船。取ると一定時間体が風船状に膨らんで宙に浮く。膨らんだ状態でゴールをするとアイテムが出現する。ダメージを受けたり変身アイテムを取って変身したりすると効果がなくなる。なお、ストックはできない。スピンジャンプをして取ると膨らんだ状態でもスピンジャンプの効果が持続する。ヨッシーに乗っている時に取ると、勝手にヨッシーから降りてしまう。
ヨッシーのタマゴ
中からヨッシーが現れる。既にヨッシーを連れている時は、代わりに1UPキノコが現れる。
ヨッシーの翼
ヨッシーに乗っている時に取るとヨッシーが青ヨッシーになり、ボーナスステージへ自動的にワープする。ボーナスステージ上では口に物を含んでいなくても空を飛ぶことができ、谷底に落下するとその時点でコースクリアとなる。落下時にヨッシーに乗っていれば、コースクリア以降も青ヨッシーのままである。ヨッシーに乗っていないときは出現しても入手できない。
手に持てるアイテム

下記のものは水中面で持つと浮くことができ、泳ぐ速度が若干上がる。カギとチビヨッシーは持ったままゴールすると、マリオの状態に関係なく1UPキノコに変化する。
Pスイッチ
青色のものを踏むとコインが「プンプンブロック」（茶色のブロック）に、プンプンブロックがコインに変化するほか、隠しコインや扉や隠しハテナブロック（この場合のハテナブロックは叩けば必ずコインが出てくるが、隠しハテナブロックを叩いた後のコインを取らず効果が消えたら、プンプンブロックに変わる。）が出現する。銀色のものを踏むと一部の敵キャラクターが銀コインに変わる。この銀コインは取るごとに得点が上がり8枚目は1UP、9枚目は2UP、10枚目以降は全て3UPとなる。青色・銀色ともに、踏んでから一定時間が経過すると効果が消える。
ジャンプ台
上に乗って高くジャンプできる。外観や機能は『1』『2』のジャンプ台に準じるが、今作では持ち運べるようになった。
カギ
鍵穴に差し込むと通常のゴール時とは別の道が開ける。ヨッシーと一緒に入る時はカギを口に含んで鍵穴に重なれば入れる。通常のゴールではなくカギを使って鍵穴からゴールしないと先に進めないステージもある。
チビヨッシー
スターロードにいるヨッシーの幼体。敵を5匹またはアイテムを1つ食べると成体となり、普通のヨッシーのように騎乗できる。
ノコノコの甲羅
ノコノコの甲羅。今作ではノコノコを踏みつけると甲羅から本体が飛び出し、甲羅がその場に残るようになった。甲羅だけ置いてある場合もある。なお、置かれている甲羅に甲羅のないノコノコが入った場合、そのノコノコが甲羅を背負って動き出す。
ブルブルブロック
ノコノコの甲羅と同じように扱えるが、壁にぶつかると砕ける。持ったまま放っておくと点滅して消える。
木の実

ヨッシーが一定個数食べることにより特定の効果が現れる。ヨッシーの口元にある場合はボタンを押さなくても自動的に食べる。いずれもコイン扱い。
赤い木の実
10個食べるとスーパーキノコを出す。
ピンクの木の実
2個食べると小さな雲を出す。その雲が放出するニコニコマークのコインを全て取れば最後に1UPキノコが手に入る。
緑の木の実
スペシャルゾーンの最終面にのみ登場。食べると残りタイムが20増える。なお、タイムが100を切った後に食べて100以上に戻った場合でもBGMのテンポは戻らず、その状態で再び100を切ると、BGMのテンポがさらに速くなる。日本国外版では設置量が多い。
その他
コイン
100枚集めると残り人数が1人増える。今作では姿が見えているものは0点、ブロックを叩いて出現したものは10点となる。
コントロールコイン
特定のブロックをたたくことで出現する特殊なコイン。叩くと同時に数珠のように連なりながら延々と伸びていく。制限時間内に十字キーを使って伸びる方向を操作することができ、時間切れになったり、壁や既に出現したコインとぶつかると止まる。出現したコインを取ることも可能だが、付近にあるPスイッチと併用してブロックに変え足場として利用することが多い。
ドラゴンコイン
ヨッシーの絵が描かれたコイン。基本的に各コースに5枚存在し（無いコースや6枚以上存在するコースもある）、1コースの中で5枚取れば残り人数が1人増える（1 - 4枚目は得点加算）。6枚以上ある場合、6枚目以降は取るたびに1UP。通常のコインと同じく1コインとしてもカウントされる。
スーパースター
取ると一定時間無敵状態となり、触れるだけでほとんどの敵を倒せる。8匹目以降は1UP（ハナチャンのみ9匹目以降は2UP）。なお、ストックはできない。
1UPキノコ
取ると残り人数が1人増える。
3UPムーン
取ると残り人数が3人増える。ごく限られた場所に置かれている。
仕掛け・トラップ
クルクルブロック
叩くと一定時間回転し、すり抜ける事ができる。通常のマリオ（ルイージ）以外の時はスピンジャンプで上から踏むことで破壊可能。アイテムが入っているブロックもある。なお、アイテムが入ってるブロックは破壊不可。
ハテナブロック
表面に「?」マークが描かれたブロック。今作ではクルクルブロックに「?」マークが回転するデザインとなっている。叩くと中からアイテムが現れる。
プンプンブロック
茶色のブロック。アイテムが出た後のブロックはこれになる。リフトのように動き出すものもある。Pスイッチを踏むとコインに変化する。前作までのカラブロックに相当する。
ブルブルブロック
青いブロック。持って投げることができる。前作の白ブロックと同様。
ジャンプブロック
表面に音符が描かれた白色のブロック。上に乗ると高くジャンプできる。
メッセージブロック
スピーカー状のブロック。叩くとヒントメッセージが表示される。
スイッチブロック
表面に「ON」「OFF」と書かれたブロック。リフトの進路などを切り替える。
フライングハテナブロック
羽根の生えたハテナブロック。一方向に飛んでくるものと一定区間を往復するものの2種類がある。マントで横方向から叩くことはできない。
ボーナスブロック
白い星印が描かれた緑色のブロック。コース内で取ったコインの枚数が30枚以上だと、中から1UPキノコが出る。30枚未満の場合はコイン1枚が出る。
ビックリブロック
表面に「!」マークが描かれたブロック。黄・緑・赤・青の4種類がある。初期状態では空中に点線のみが記されているが、特定の場所にある巨大なビックリスイッチを押すことで、スイッチと同じ色の点線が描かれている位置にその色のブロックが出現する。黄色ブロックを叩くとスーパーキノコ、緑ブロックを叩くとマント羽根が出現し、プンプンブロックに変化する。赤・青のブロックは叩いても変化しない。ブロックを出現させることにより新たな足場が作り出されるため、難易度を低下させることができる。逆にスイッチを1つも押さずにクリアすることも可能である。
三角ブロック
特定の場所の壁と地面に接するように置かれた三角形のブロック。このブロックに向けてダッシュすると壁を登ることができる。ヨッシーに乗っているときはジャンプ台と同じ役割。
トゲ棍棒
トゲの付いた棒で、突然天井から落ちてくるものと床下から突き上がってくるものがある。