一度エンディングを迎えた後は、タイトル画面でワールドの選択ができるようになるほか、再度ゲームを開始するとハードモードとなり、敵キャラクターの変更や移動速度の上昇、リフトの幅の短縮、障害物の追加など、全体に難易度が高くなる。これを通称「裏面」「2周目」などと呼ぶことがある。このモードは、電源を切るまで有効となっている。

各面にはTIME（時間制限）が設定されており、ステージが始まるとこの数値がカウントダウンし始める。設定TIMEは400または300で、カウントダウンのペースは秒よりもかなり速い（1カウントはおよそ0.4秒）。この数値が0になるまでに、エリアをクリアしなければならない。TIMEが100未満になるとそのことを示す警告音が流れ、BGMのテンポが速くなる。エリア1からエリア3をクリアしたときは、残りのTIMEの数値が得点に精算される。

ミスをした場合、ミスした地点からではなく、ステージの中間地点を過ぎていない場合はスタート地点から、過ぎている場合は中間地点から再スタートするようになっている。ただし、一部のコースでは中間地点が存在せず、ミスした地点に関係なくスタート地点からの再スタートとなる場合もある。
アクション

マリオが取るアクションは、通常は水平方向への移動とジャンプのみである。

十字キーの左右を押すことで左右に移動する。スーパーマリオやファイアマリオ（後述）のときに十字キーの下を押すとしゃがむことができる。また、Bボタンを押しながら移動すると十字キーを押した方向に走ることができる。この走る動作はBダッシュと呼ばれる。ダッシュ中は1マスの隙間なら落ちずに走り抜けることができる。一度ダッシュするとキーから指を離してもすぐには止まらず進むほか、スーパーマリオやファイアマリオのときにダッシュしたまましゃがむと、しゃがんだ状態で左右に滑る。これを利用してスーパーマリオやファイアマリオのときには通常では通ることができない高さ1マスの隙間に滑りこむことができる。

Aボタンを押すとジャンプできる。ボタンを押した長さによって高度が変わったり、ジャンプ中に左右に十字キーを押すことで飛ぶ軌道や着地点を操作できる、Bダッシュによって加速度をつけて遠くに跳べるなど、自由度の高い制御が可能である。空中に浮いているブロックなどに向かってジャンプすると、そのブロックを下から叩くことができる。また、ジャンプ中の左右への制御はマリオの後ろ側に利きやすいという特徴がある。このジャンプシステムは後の多くの作品にも模倣された。海中ステージではマリオは徐々に沈んでしまうため、Aボタンを押して水をかき、浮き上がるように調整しなくてはならない。

十字キーとAボタンを使い敵の真上に着地するとその敵を踏みつけることになる。本作ではこの方法で敵を踏みつけるのが最も基本的な攻撃方法となる。ただしこの方法で倒せない敵もある。また、ブロックの上にいる敵はそのブロックを下から叩くことで倒すことができる。

マリオはアイテムを取ることによりスーパーマリオ、ファイアマリオへとパワーアップすることができる。スーパーマリオは身長が普通のマリオの2倍になり、レンガブロックを下からパンチして破壊することができるようになる[14]。また、ファイアマリオはBボタンでファイアボールを投げることができ、ファイアボールを敵にぶつけると、踏めない敵や水中の敵でも倒すことができる。ただし、ファイアボールが効かない敵も存在する。

スーパーマリオからの対比で、普通のマリオ（初期状態）をチビマリオと称すことが多い。本稿においてはこの普通のマリオを便宜上チビマリオと記述し、単にマリオと表記する場合は、マリオのパワーアップに関係なくキャラクター個人として表記することを原則とする[注釈 2]。

ノコノコとメットを踏みつけると気絶し、気絶中のノコノコやメットに触れると甲羅を前方に蹴飛ばすことができる。その甲羅が他の敵に当たれば、その敵を倒すこともできる。甲羅で連続して敵を倒すか、あるいは連続で敵や甲羅を踏みつけると得られる得点が増加していく。そして8000点が出るとその次以降は1UP、すなわちマリオの残り人数が1増えることとなる[14]。ただし甲羅は障害物に当たると跳ね返って反対方向に進む。このシステムを応用して、階段状の地形で甲羅を踏み続けて1UPを続ける技術が「無限1UP（無限増殖、100人マリオとも）」である[15]。

敵キャラクターや自分の蹴った甲羅などに横または下からぶつかるとダメージを受ける。水中面の敵や「踏めない敵」、ファイアバー、敵が放つ武器はどの方向からぶつかってもダメージとなる。ダメージを受けた場合、スーパーマリオかファイアマリオの場合はチビマリオに戻り、チビマリオの場合は1ミスとなり残り人数が1人減る[14]。また、穴に落ちた場合やタイムアップになった場合は、パワーアップ状態の有無に関係なく即ミスとなる。

ゲームスタート時の残り人数は3から始まり、残り人数が尽きる（1の状態でミスをする）とゲームオーバーになる。ゲームオーバーになるとワールド1からやり直しとなってしまうが、ゲームオーバー直後のタイトル画面でAボタンを押しながらスタートボタンを押すことで、ゲームオーバーとなったワールドの最初からやり直す事が出来るというコンティニューの裏技が存在する[14]（得点は0に戻る）。
登場キャラクター
主要キャラクター
マリオ
主人公。得意のジャンプとダッシュでピーチをさらったクッパを倒し、キノコ王国を救うために冒険に出る。
ルイージ
マリオの双子の弟。2人交代プレイの場合は、コントローラIでマリオを、コントローラIIでルイージを操作することになる。説明書にはルイージに関する記述が全くない。
ピーチ
キノコ王国の姫。クッパの魔法を解くことができる唯一の人物。クッパによってワールド8の城に囚われている。
キノピオ
ピーチに仕えるキノコ王国の住人。ワールド1から7までの城に囚われている。
クッパ
キノコ王国を乗っ取ろうとする「カメ一族」の親玉で大魔王。魔法によってキノコ王国の住人をブロックなどに変え、魔法を解く力を持つピーチ姫をさらった。全8ステージの城に登場するが、キノピオが囚われているワールド1から7までの城に登場するのは部下が変身した偽者でありファイアボールで倒せばその正体を確認できる。偽者の正体はステージ1から順にクリボー、ノコノコ（緑）、メット、トゲゾー、ジュゲム、ゲッソー、ハンマーブロスである。『2』でもこの順は同じである。攻撃手段はワールド1?5までは炎、ワールド6と7はハンマー投げ（画面に現れるまでは炎）、ワールド8の本物のクッパはハンマー投げと炎の両方を使う。
敵キャラクター「スーパーマリオブラザーズシリーズのキャラクター一覧#スーパーマリオブラザーズ」を参照