ブルックリンに住む高校生のマイルス・モラレスは、叔父のアーロンと高架下でグラフィティをしている時、突然変異したクモに噛まれ、特殊な能力を得る。マイルスは駅の地下道でウィルソン・フィスク（キングピン）とグリーン・ゴブリンたちが加速器を使って、異次元との扉を開く実験をしているところに居合わせる。スパイダーマン（ピーター・パーカー）が現れ、実験を阻止しようとするが、加速器が誤作動し重症を負う。ピーターはマイルスに小型のメモリースティックを託した後、キングピンによって殺害された。

ニューヨーク中にスパイダーマンの死を知らせるニュースが広がり、後に彼の告別式が開かれる。マイルスはピーターの意思を継ぎスパイダーマンになるため訓練を始めるが、その過程でメモリースティックを壊してしまう。異次元から来た別のピーター・パーカー（ピーターBパーカー）が現れ、自分の次元に帰るためマイルスに協力することとなる。マイルスが受け取ったメモリースティックは、キングピンの加速器を無力化させることが出来る装置だったことが分かる。マイルスとピーターBパーカーはスパイダーマンのコスチュームを着てキングピンの研究施設に潜入し、装置を修理するためのデータを盗み出そうする。

二人はドクター・オクトパスと施設員らに発見され追跡されるが、さらに別の次元から来たスパイダーグウェン（グウェン・ステイシー）に助けられ危機を脱する。グウェンは二人を、ピーター・パーカーの叔母メイの家に連れて行く。マイルス、ピーターBパーカーはそこで、フィルム・ノワール世界のスパイダーマン・ノワール、アニメ世界の少女ペニー・パーカー、動物キャラクター世界の子豚型スパイダーマン・スパイダー・ハムたちと出会う。異次元から来たヒーロー達は全員、マイルスの次元にいることによって次第に弱って行き、やがては死んでしまうことが分かる。マイルスは彼らをもとの次元に送り返すことを決意する。

ペニーが装置を修理する間、ピーターBパーカーはマイルスの能力をコントロールするため、彼に指導しようとするが成果が上がらない。マイルスは他のヒーローからの重圧に耐えられなくなり、叔父アーロンと会おうとするが、彼の正体がキングピンの手下でヴィランのプラウラーであることを知る。この事実に衝撃を受けたマイルスはメイの家に逃げ帰り、ヒーローたちに叔父がキングピンの手下だったことを説明する。そこにマイルスを尾行してきたキングピン、プラウラー、ドクター・オクトパス、スコーピオン、トゥームストーンが現れ、ヒーローたちと戦闘になる。
キャスト

役名俳優日本語吹替[6]
マイルス・モラレス / スパイダーマンシャメイク・ムーア（英語版）小野賢章[7][8][9]
ピーター・B・パーカー / スパイダーマンジェイク・ジョンソン宮野真守[7][8][9]
グウェン・ステイシー / スパイダーグウェンヘイリー・スタインフェルド悠木碧[7][8][9]
ピーター・パーカー / スパイダーマン・ノワール（英語版）ニコラス・ケイジ大塚明夫[10][8][9]
ペニー・パーカーキミコ・グレン高橋李依[10][8][9]
ピーター・ポーカー / スパイダー・ハム（英語版）ジョン・ムレイニー（英語版）吉野裕行[10][8][9]
ピーター・パーカー / スパイダーマンクリス・パイン[11][12]中村悠一[9]
ウィルソン・フィスク / キングピンリーヴ・シュレイバー玄田哲章[10][8][9]
アーロン・デイヴィス / プラウラー（英語版）マハーシャラ・アリ稲田徹[8][9]
ジェファーソン・デイヴィスブライアン・タイリー・ヘンリー乃村健次[13][9]
リオ・モラレスルナ・ローレン・ベレス小島幸子[9]
メイ・パーカー（英語版）リリー・トムリン沢海陽子[9]