その後4年間に数本のアリス映画を製作した後、ウィンクラーはスタジオの映画を配給する役割を夫のチャールズ・ミンツに譲った。1927年、ミンツは新しい映画シリーズの製作を依頼し、それに応えてディズニーは、オズワルド・ザ・ラッキー・ラビットというキャラクターを主役にした初の全編アニメーション映画シリーズを製作した[47]。このシリーズはウィンクラー・ピクチャーズが製作し、ユニバーサル・ピクチャーズが配給した。ウォルト・ディズニー・スタジオは合計26本のオズワルドの短編を完成させた[48]。

1928年、ウォルトは映画の製作費を増額しようとしたが、ミンツは減額を望んだ。その直後、ウォルトはユニバーサル・ピクチャーズがオズワルドの権利を所有していることを知り、ミンツは減額に応じなければオズワルド抜きで映画を製作すると脅した[48][49]。ウォルトはこれを断り、ミンツはウォルト・ディズニー・スタジオの主要なアニメーター4人と契約して自分のスタジオを立ち上げた[50]。ウォルトとアイワークスはオズワルドの代わりにネズミのキャラクターを作り、もともとモーティマーマウスと名付けられていたネズミを、ディズニーの妻に促され、ミッキー・マウスと呼ぶようになった[51][52]。1928年5月、スタジオは新キャラクターの試写会としてサイレント映画『プレーン・クレイジー』と『ギャロッピン・ガウチョ』を製作した。スタジオは初のトーキー映画、ミッキー・マウス・シリーズ3作目の短編『蒸気船ウィリー』を製作した。この作品は音の同期が取られており、世界初のトーキーアニメーションとして製作された[10]。音響は、リー・デ・フォレストのフォノフィルム・システムを使用したパワーズのシネフォン・システムを使って制作された[53]。パット・パワーズの配給会社は『蒸気船ウィリー』を配給し、すぐに大ヒット作となった[51][54][55]。その後、ディズニーは1929年に前2作をトーキー映画として再公開することになった[56][57]。ディズニーが2006年まで権利を持っていなかったが、オズワルド・ザ・ラッキー・ラビットはディズニーが初めて手がけたアニメキャラクターの1つである。

ニューヨークのコロニーシアターで『蒸気船ウィリー』が公開された後、ミッキーマウスは絶大な人気を誇るキャラクターとなった[57][51]。ディズニー・ブラザース・スタジオは、ミッキーや他のキャラクターが登場するアニメをいくつか制作した[58]。1929年8月、ディズニー兄弟がパワーズから利益の分配を受けていないと感じたため、同社はコロンビア・ピクチャーズを配給会社としてシリー・シンフォニー・シリーズの製作を開始した[55]。パワーズはアイワークスとの契約に終止符を打ち、アイワークスは後に自身のスタジオを立ち上げた[59]。カール・W・スタリングはシリーズ開始にあたって重要な役割を果たし、初期の作品の音楽を担当したが、アイワークスの退社後は会社を去った[60][61]。9月、劇場支配人のハリー・ウッディンは、観客動員数を増やすため、自分の劇場であるフォックスドームでミッキーマウス・クラブを始める許可を求めた。ウォルトは同意したが、ウッディンが始める前にデビッド・E・ダウがエルシノア劇場でミッキーマウス・クラブを始めた。ウォルトはこれに同意したが、ウッディンがクラブを始める前にデビッド・E・ダウがエルシノア劇場でクラブを始めた。12月21日、エルシノア劇場で開かれたクラブの第1回集会に約1,200人の子供たちが参加した[62][63]。1930年7月24日、キング・フィーチャーズ・シンジケートの社長ジョセフ・コンリーは、ディズニー・スタジオに「ミッキーマウスの漫画を描いてほしい」と郵便を送った[64]。1930年12月16日、ウォルト・ディズニー・スタジオはウォルト・ディズニー・プロダクション（Walt Disney Productions, Limited）となり、ウォルト・ディズニー・エンタープライゼズ（Walt Disney Enterprises）というマーチャンダイジング部門と、ディズニー・フィルム・レコーディング・カンパニー（Disney Film Recording Company, Limited）とリルド・リアルティ・アンド・インベストメント・カンパニー（Liled Realty and Investment Company）という子会社を設立した。ウォルトと彼の妻が60％（6,000株）、ロイが40％を所有していた[65]。ミッキー・マウスシリーズ初の音入りの短編アニメーション『蒸気船ウィリー』（1928年）の一場面である。

1930年1月13日に「ニューヨーク・デイリーミラー」紙に掲載されたミッキーマウスの漫画は、1931年にはアメリカ国内の60の新聞と、世界20カ国の新聞に掲載されるようになった[66]。ミッキー・マウスのキャラクターを使ったグッズを発売すれば、会社の収益が上がると考えたニューヨーク在住のある男は、ウォルトに300ドルのライセンス料を提示し、彼が製造していた筆記用具にミッキーマウスを載せることを許可した。ウォルトはこれを受け入れ、ミッキー・マウスは最初のライセンスキャラクターとなった[67][68]。1933年、ウォルトはディズニーの商品化をカンザス・シティの広告会社のオーナー、ケイ・カメンに依頼した。1年以内にケイメンはミッキーマウスのライセンスを40件取得し、2年以内に3,500万ドルの売上を達成した。1934年、ウォルトはミッキー・マウスのマーチャンダイジングで、そのキャラクターの映画よりも多くの利益を得たと語った[69][70]。