オブザーバーが出演の際、男女共通して週替わりのサポートMCまたは蛍原（宮迫降板前は宮迫）の隣へ座る[注 9]。その際は当人が収録前にマイクの風防（カバー）の色を決め、それによってMCやパネリストとの絡みのレベルを決めるというルールがある。

深夜の30分時代にはゲストによって放送を2回にまたぐこともあり、さらに先週のゲスト未放送分 → 今週のゲスト登場 → そのまま次週に続くというパターンも多かった。55分に拡大してからはほぼ全ての内容を1回で全て完結させているのでこのパターンは見られなくなったが、2008年2月7日・14日放送は「出川ナイト」として初の2週連続放送を行った。さらに、2012年5月17日・24日放送の「博多華丸・大吉芸人」では、収録開始の時点で2週連続での放送が決まっていた[注 10]。

2016年10月から2018年9月まで、従来（木曜放送）の『雨上がり決死隊のトーク番組アメトーーク!』・『日曜もアメトーーク!』と週2回体制となっていたが、両者の放送内容は大きく変わらなかった。従来版が、ある程度マニアックな「くくり」であることが多かった。

2020年5月21日放送の「おうち大好き芸人」からは新型コロナウイルス感染防止のため、一部の出演者はリモート収録で行い[注 11]、出演者の間にアクリル板を設置して収録している。（2023年現在、コンビ同士にはアクリル板は設置していない）
くくりトーク

番組開始当初は通常のトークも行われていたが、2004年6月14日に眼鏡を着用している芸人を集めた「メガネ芸人」を放送した際、出演者・スタッフ共に手応えを感じたため「共通点を持った芸人を集めたトーク」というシステムの原型になった。以降は「所属事務所が同じ芸人」を集めたトークなどが多く行われている。

その後、芸人自身がやりたい企画をプレゼンして実現を目指す「プレゼン大会」がスタート。「ある共通の趣味や特徴をもった芸人を集めてトークする」という旨の企画が多くプレゼンされた。このプレゼン大会から「ガンダム芸人」「華の昭和47年組」など数々の企画が実現、「あるくくりを持ったゲストを集めてトークする」というスタイルが完成した（芸人以外がプレゼンする場合もある）。

当初はゲスト芸人が登場した後に蛍原が「皆さんは、何のくくりですか?」と聞き、1名が「僕たちは（私たちは）、」と言った後に全員で「〇〇芸人です!!」と名乗ってから始めていたが廃止され[いつ?]、オープニングで蛍原が紹介するようになった。ただし「胸デカイ芸人」（2018年6月21日）、「BiSHドハマリ芸人」（2019年10月10日）など時折復活することがある。

この「くくりトーク」というシステムは、実際にはテレビ東京『やりにげコージー』や読売テレビ『ダウンタウンDX』、日本テレビ『踊る!さんま御殿!!』のスペシャルなどですでに行われていたが、2007年6月号の「日経エンタテインメント!」では「くくりトーク」を紹介する記事が掲載され、その注目を集めるきっかけとなった番組としてフジテレビ『HEY!HEY!HEY!』の「ゆかりトーク」と共に当番組の「くくりトーク」を紹介している[18]。

『アメトーーク!』の、上記の番組と異なるシステムとして「打ち合わせ」がある。例えば多数のゲストを集めてトーク番組を収録する時、通常はゲストがそれぞれ打ち合わせをする。しかし『アメトーーク!』では事前にゲスト全員を一堂に集めて、全員で打ち合わせを行っている。これにより、その趣味を持った人にしか思いつかないような面白い話やトークテーマが多く生まれるという。またゲスト同士で強い連帯感が生まれ、例えば出演者の1人がトークなどで失敗しても他の出演者がそれをカバーするなどといった光景も見られる[18]。

部活動経験者、スポーツ、音楽や歌手、特定のタレント、アニメや漫画、食べ物、ゲームをテーマにしたくくりといったお笑い以外にもスポットを当てたテーマも取り上げるため、多岐に渡ってテーマが存在する。取り上げられたジャンルは放送終了後に当該ジャンルのWebサイトへのアクセス及びセールスが上昇し、とりわけ外食チェーン店の場合は店舗に客が殺到するなど店に対する反響も大きい[19]。
セット

基本的にセットには雨上がり決死隊を表した巨大な「雨」→蛍原の「ホ」や、カエルのオブジェなどで鮮やかに装飾されているが、トークテーマに合わせてセットが変わることがある。例えば「立ち食いそば芸人」ではゲストの席がそば屋のカウンター風、山口智充がゲストの回では山口が四角いものを好むためバックの雨の文字が角張っている、「ジョジョの奇妙な芸人」では石仮面など。この他にもセット変更例は多数あり、回によっては採り上げる当人から借りたグッズが使用されることがある。
出演者

司会の雨上がり→蛍原と同じく主に吉本興業所属のタレントが数多く出演し、吉本芸人が雨上がり→蛍原のみしか出演しない回はごく稀にしかない。その一方で吉本以外の「所属事務所が同じ芸人」を集めたトークも定期的に行われ、とりわけ個性的な芸人をフィーチャーした「〇〇ナイト」と銘打った企画なども組まれている。
MC
蛍原徹[注 12]
字幕テロップは水色。進行・聞き手に専念し、コーナーのタイトルコールも普段は蛍原が担当。宮迫とは対照的に漫画・アニメ・特撮・ゲームなどに疎く、ファンであれば知っていて当然の話題に素っ頓狂な受け答えをするのはしょっちゅうだが、自身の趣味である競馬・麻雀・プロ野球・ゴルフ・ドラマ『北の国から』の話題になるとトークに割り込むことも。またボケることも少なくなく、その度に宮迫からツッコまれているがコンビ間で「蛍原は収録1回につきボケるのは1回まで」という取り決めがあったらしい[20]。「バイク芸人」では水平乗り（フライング乗り）をするのがお約束となっていたため、「アメトーーク! フィギュアストラップ」では蛍原のポーズにも採用された[21]。宮迫降板後はボケる回数も増え、2019年末のアメトーーク!大賞では流行語大賞と反省大賞を同時受賞[22]。蛍原が体調不良の際は代役MCとして、狩野英孝、陣内智則、土田晃之が務めている。「絵心ない芸人」はパネリスト側のゲストとして出演する。
サブMC

宮迫の降板以降は蛍原の単独MCだったが、2019年8月以降は東野幸治、土田晃之、博多華丸・大吉、設楽統（バナナマン）、有吉弘行、高橋茂雄（サバンナ）、陣内智則、礼二（中川家）、ケンドーコバヤシ、おぎやはぎ、バカリズム、飯塚悟志（東京03）、川島明（麒麟）、山崎弘也（アンタッチャブル）、千鳥、田中卓志（アンガールズ）、かまいたち、三村マサカズ（さまぁ?ず）、後藤輝基（フットボールアワー）、塙宣之（ナイツ）などといったツッコミ担当や機転を利かせてツッコめる芸人などが単独MCとして番組を支える蛍原の横に付いて週替わりでサポート役を担当している[注 13]。サブを担当する芸人はその日のトークテーマに対して未知だったり、詳しく関係ない人物が担当するのが通例となっている。さらにゴールデンSPでは幾度か田村淳（ロンドンブーツ1号2号）が相方の地上波復帰まで担当しており、年末SPではサブMCではないが蛍原の横に明石家さんまが座った。
過去のMC
宮迫博之（当時雨上がり決死隊、2003年4月7日 - 2019年6月20日、2021年8月17日）
字幕テロップは黄色。積極的にトークへ加わり、特に自身の趣味である漫画やアニメなどを扱った回では進行を忘れ、ゲストと共に熱中することも多かったが共演者同士だけでトークが盛り上がった際には「TVショーですよ」と注意することがあった。2019年6月、宮迫をはじめとした芸人らが特殊詐欺グループとされる反社会的勢力主催の会合へ参加し、一定の現金を受け取っていた問題（いわゆる「闇営業問題」）が発覚し、6月24日に吉本興業がこの件に関係した宮迫を含む所属芸人11名を当面の間、活動を停止し謹慎処分とすることを決定した[10]ため、6月27日放送分から7月11日放送分まで、宮迫の出演シーンをカット（映ったとしても胴体の一部が映る程度）して放送し、番組表のMC表記も蛍原のみとなった。