当初、本作はグウェン・ステイシーとメリー・ジェーン・ワトソンのダブルヒロインになると報じられたが[25]、後にグウェン・ステイシーのみになることがわかった[27]。2010年8月ではヒロイン役候補リストにイモージェン・プーツ、オフィリア・ロヴィボンド、リリー・コリンズ、テリーサ・パーマー、エマ・ロバーツが含まれ[28]、さらに9月に『バラエティ』誌がエマ・ストーンとミア・ワシコウスカも候補に挙がっていると報じた[29]。更に後にディアナ・アグロン、ジョージナ・ヘイグ、ドミニク・マケリゴットも追加された[30]。2010年10月5日、グウェン・ステイシー役はエマ・ストーンに決定したことが報じられた[31]。

2010年6月9日、リブート版のヴィランがリザードになるかもしれないという噂が表面化した[32]。ソニーはクリストフ・ヴァルツにする構えであると報じられた[33]が、ヴァルツ側は否定した[34]。 また、マイケル・ファスベンダーは『X-MEN:ファースト・ジェネレーション』のマグニートー役に決まる前には、本作のヴィラン候補であった[35]。2010年10月11日、リス・エヴァンスがヴィラン（この時点では名称不明）を演じることが確定した[36]10月13日、リス・エヴァンス演じるヴィランはドクター・カート・コナーズことリザードになることが報じられた[37]（2011年7月に、サンディエゴ・コミコンで、リス・エヴァンスの演じるヴィランがリザードであると、監督のマーク・ウェブ自ら発表し、その映像が３Dでお披露目になった[38]。）12月10日、マイルズ・エリオットがビリー・コナーズ（カート・コナーズの息子）を演じると報じられた[39]。12月3日、ヴァン・アッターという名の新たなヴィランをイルファーン・カーン、その妻をアニー・パリッセが演じることがわかった[40]。

2010年10月、J・ジョナ・ジェイムソン役にジョン・スラッテリー、サム・エリオットが候補に挙がっていると報じられた[41]。2010年11月4日、ベンおじさんをマーティン・シーンが演じることがわかった[42]。また、メイおばさんはサリー・フィールドになる可能性があることが明らかとなった[43]。さらにベティ・ブラント役にズーイー・デシャネルの名が挙がっていることが報じられた[44]。