一方、ハリーは父ノーマンと同様に不治の病に侵されており、その症状が現れ始めていた。ハリーは父ノーマンが残した過去の研究データから、治療するにはスパイダーマンの血液が必要だという結論に達する。ハリーはスパイダーマンを撮影したことがあるピーターを頼ったが、彼はコナーズ博士の経緯から輸血の影響を危険と考え、改めてスパイダーマンとして現れ、直接ハリーに血液の提供を拒否する。自分の命を顧みなかったと誤解したハリーはスパイダーマンに強い憎しみを抱くようになる。
オズコープ副社長のドナルド・メンケンを含む役員達は、ハリーに手を焼いていた。ハリーは経営に興味が無い上に気に入った女性（フェリシア・ハーディ）を実績のないまま、いきなり自分の秘書兼CEO補佐に抜擢するなど縁故主義的なやり方で重役達の不満を買い、やがてエレクトロ誕生の責任をなすりつけられる形で会社から追放されてしまう。ハリーはエレクトロと共にオズコープに乗り込み、蜘蛛の毒素を使って自らの病を完治させようとしたが、毒素によって体を蝕まれて狂気に染まり、「グリーン・ゴブリン」に変貌する。スパイダーマンのせいでこうなったと思い込んだハリーはエレクトロと共謀してスパイダーマンの抹殺に動き出す。
ピーターは父リチャードが残した情報から破棄された地下鉄の隠し研究室を突き止め、そこに残されていたビデオメッセージから失踪した理由を知る。その直後エレクトロが再び街中の電気を吸い取り、ニューヨーク一帯を停電させてしまう。スパイダーマンとグウェンは協力して発電所を再起動させ、過電流を浴びせてエレクトロを倒すが、安堵するのも束の間グリーン・ゴブリンが現れた。ゴブリンに連れ去られたグウェンは、時計塔の頂上から突き落とされる。その直後、ゴブリンはスパイダーマンとの格闘の末、気絶する。一方、落下するグウェンをスパイダーマンが間一髪で掴み取ったかに見えたが、彼女の頭部は地面に打ち付けられており、即死してしまう。グウェンの死に強いショックを受けたピーターは、スパイダーマンとしての自警活動を止めてしまう。
アレクセイ・シツェビッチは脱獄し、ノーマンが作り出した兵器を身に着けライノとして暴れ出す。ピーターはグウェンの卒業スピーチで自信を取り戻し、スパイダーマンとして再びライノの前に現れ、これからもニューヨークの平和を守り続ける事を改めて決意する。 役名俳優日本語吹替
キャスト
ピーター・パーカー / スパイダーマンアンドリュー・ガーフィールド前野智昭[4]
グウェン・ステイシーエマ・ストーン本名陽子[4]
マックス・ディロン / エレクトロジェイミー・フォックス中村獅童[4][5]
ハリー・オズボーン / グリーン・ゴブリンデイン・デハーン石田彰[4]
ドナルド・メンケンコルム・フィオール家中宏[4]
フェリシアフェリシティ・ジョーンズ[6]森夏姫
アレクセイ・シツェビッチ / ライノポール・ジアマッティ[6][7]楠見尚己[4]
メイ・パーカー
メアリー・パーカー（英語版）エンベス・デイヴィッツ吉田美保
リチャード・パーカー（英語版）キャンベル・スコットてらそままさき
アシュレイ・カフカ博士（英語版）マートン・チョーカシュ[8]梅津秀行
黒服の男ルイス・キャンセルミ鈴木幸二
幼いピーターマックス・チャールズ関根航
アリスター・スマイス（英語版）B・J・ノヴァク[9]花輪英司