ポリメラーゼ連鎖反応 - 暇つぶしWikipedia

ポリメラーゼ連鎖反応

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「PCR検査」はこの項目へ転送されています。新型コロナウイルス感染症および新型コロナウイルスに関する臨床検査については「COVID-19の検査」をご覧ください。
100μLの反応混合物が入っている8連PCRチューブ卓上型PCR装置

ポリメラーゼ連鎖反応（ポリメラーゼれんさはんのう、英語: polymerase chain reaction）とは、DNAサンプルの特定領域を増幅させる反応。

一般的には数百万?数十億倍に増幅する。英語読みもされるが、その頭文字を取ってPCR法、あるいは単純にPCRと呼ばれることが多い [1][2]。
解説

DNAポリメラーゼと呼ばれる酵素の働きを利用して、一連の温度変化のサイクルを経て任意の遺伝子領域やゲノム領域のコピーを指数関数的に増幅することで、少量のDNAサンプルからその詳細を解析するに十分な量にまで増幅することが目的である [3][4][5]。医療や分子生物学や法医学などの分野で広く使用されている有用な技術である。1983年にキャリー・マリス（Kary Mullis）によって発明され [6][7]、これによりマリスはノーベル賞を受賞した。

PCR法が確立したことにより、DNA配列クローニングや配列決定、遺伝子変異誘導といった実験が容易かつ迅速になった。分子遺伝学や生理学、分類学などの研究分野で活用されている。古代DNAサンプルの解析、法医学や親子鑑定などで利用されるDNA型鑑定、感染性病原体の特定や感染症診断に関わる技術開発(核酸増幅検査)、などにも用いられる。また、PCR法から逆転写ポリメラーゼ連鎖反応やリアルタイムPCR、DNAシークエンシング等の技術が派生して開発されている。今日では、生物学や医学をはじめとする幅広い分野における遺伝子解析の基礎となっている [8][9]。
原理完全なPCRサイクルの概略図

PCR法は、試薬を混交したDNA溶液の温度を上げて下げる、という一連の熱サイクルによって動作する。このDNAサンプルの加熱と冷却の繰り返しサイクルの中で、二本鎖DNAの乖離、プライマーの結合、酵素反応によるDNA合成、という3つの反応が進み、最終的に特定領域のDNA断片が大量に複製される。

PCR法では、増幅対象（テンプレート）のDNAサンプルの他に、大量のプライマー（標的DNA領域に相補的な配列を持つ短い一本鎖DNA〈オリゴヌクレオチド〉）とDNAの構成要素である遊離ヌクレオチド、そしてポリメラーゼの一種であるDNA合成酵素（DNAポリメラーゼ）という3つの試薬を使用する。古いタイプのPCR用3温度サーマルサイクラー
最初のステップでは、DNA二重らせんの2本鎖DNAを高温下で変性させ、1本鎖DNAに物理的に分離する。変性が起こる温度は、DNAの塩基構成および長さ（塩基数）によって異なり、一般に長いDNAほど温度を高くする必要がある。

次に、この1本鎖DNAを含む溶液を冷却して、プライマーを一本鎖DNAの相補配列部位に結合させることで、部分的に2本鎖を作らせる（アニーリング）。冷却が急速であると、長いDNA同士では再結合して2本鎖になることは難しいが、短いDNA断片（オリゴヌクレオチド）は容易に結合できることを利用している。この結果、対象とする長い1本鎖DNAの一部にプライマーが結合したものができる。プライマーをDNAよりも圧倒的に多い状況にしておくことで、DNAとプライマーが結合する傾向はDNAとDNAが結合する傾向よりも、さらに優越的になる。

次に、溶液を若干加熱して、この2本鎖DNA部位をテンプレートとしてDNAポリメラーゼを働かせることで、プライマーが結合した部分を起点として、遊離ヌクレオチドを利用して1本鎖部分と相補的なDNAが酵素的に合成される。DNAが合成された後、再び高温にして最初のステップに戻り、このサイクルを最初のDNA変性から繰り返すことにより増幅をすすめる。PCR反応が進むことで、生成されたDNA自体が複製のテンプレートとして使用され、元のDNAテンプレートが指数関数的に増幅される連鎖反応が進む。

以上のようにPCR法は、DNA鎖長による変性とアニーリングの進行速度の違いを利用して、反応溶液の温度の上下を繰り返すだけでDNA合成を繰り返し、任意のDNAの部分領域を増幅する技術である。

使用するDNAポリメラーゼが熱に弱い場合、変性ステップの高温下でDNAとともにポリメラーゼも変性してしまい、失活してしまう。そのためPCR法の開発当初は、DNA変性時の毎回にDNAポリメラーゼを酵素として追加しており、手間と費用がかかっていた [10]。現在では、サーマスアクアティカスという好熱菌由来の熱安定性DNAポリメラーゼであるTaqポリメラーゼなどを用いることで、途中で酵素の追加をせずに反応を連続して進めることができる。
手順 PCR法の処理フロー
 準備

増幅対象のDNA領域の両端の塩基配列を決定し、対応するプライマーを人為合成する。このときプライマーは、増幅予定の2本鎖DNAの両鎖それぞれの3'側に結合する相補配列であり、通常20塩基程度である。多くの場合、実験室でカスタムメイドされるか、商業的な生化学サプライヤーから購入可能である。
反応液調製

増幅対象DNA、プライマー、DNAポリメラーゼおよびDNA合成の素材（基質）であるデオキシヌクレオチド三リン酸（dNTP）、そして酵素が働く至適塩濃度環境をつくるためのバッファー溶液を混合し、PCR装置（サーマルサイクラー）にセットする。流通しているPCR試薬キットに付属するバッファー溶液には二価カチオンが含まれていることが多い [11]。通常はマグネシウムイオン（Mg2+）であるが、PCR媒介DNA突然変異誘発が高いマンガンイオン（Mn2+）を使用することで、あえてDNA合成の間のエラー率を増加させることも可能である [12]。Taq DNAポリメラーゼの場合、一価カチオンとしてカリウムイオン（K+）が入れられることもある [13]。また場合によっては硫酸アンモニウムを加えることもある。アンモニウムイオン（NH4+）は特にミスマッチなプライマーとテンプレート塩基対間の弱い水素結合を不安定化する効果があり、特異性を高めることができる [13]。
PCRサイクル
反応液を94°C程度に加熱し、30秒から1分間温度を保ち、2本鎖DNAを1本鎖に分かれさせる（図①）。

60°C程度（プライマーによって若干異なる）にまで急速冷却し、その1本鎖DNAとプライマーをアニーリングさせる（図②）。

プライマーの分離がおきずDNAポリメラーゼの活性に至適な温度帯まで、再び加熱する。実験目的により、その温度は60?72°C程度に設定される。DNAが合成されるのに必要な時間、増幅する長さによるが通常1?2分、この温度を保つ（図③）。

ここまでが1つのサイクルで、以後、①から③までの手順を繰り返していく事で特定のDNA断片を増幅させる。

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出典: フリー百科事典『ウィキペディア（Wikipedia）』
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