東京・大手町→箱根・芦ノ湖 5区間／108.0km
区間記録保持者：佐藤悠基（東海大学 2年） 1時間01分06秒（第83回大会・2007年）
東京・大手町読売新聞東京本社前（往路スタート）→（田町）→（国道15号）→（新八ツ山橋）→（京浜急行電鉄空港線蒲田踏切）→（六郷橋）→鶴見中継所
大手町・読売新聞東京本社前を午前8時に一斉スタート。スピードランナーや準エースクラスの投入が多い区間だが、集団になれば牽制などでスローペースになったり、それほど大きくばらけない傾向にある。そのため鶴見中継所に多数の選手が殺到することが見られる。また、スタート直後に飛び出して逃げ切りを狙う学校もあり、各校の戦術が現れる区間の1つである。
この区間で重要なのは「次につなげること（先頭の見える位置でたすきを渡すこと）」である。その為ブレーキを避けようとして近年はペースが上がらないことが多い。
コース上の大きなアップダウンは新八ツ山橋と六郷橋のみ。この付近における選手同士の駆け引きも見もの。特に六郷橋付近では下りを利用してスパートをかける選手も多い。
区間記録保持者：メクボ・ジョブ・モグス（山梨学院大学 3年） 1時間06分23秒（第84回大会・2008年）
鶴見中継所→（横浜駅前）→（国道1号）→（権太坂）→戸塚中継所
2002年から最長距離区間ではなくなったが、それでも「花の2区」と呼ばれ続けているエース区間。箱根に限らず2区はその後の流れを決める重要な区間に上げられることが多いが、各校のエース級の選手はほぼ均等な力を持っているため差が広がりにくく、この区間の結果が総合優勝争いに直結することはほとんどない。
鶴見中継所から横浜駅前を経由して保土ヶ谷までは標高がほぼ0の平坦なコースであり、差はほとんどつかない。
保土ヶ谷駅から権太坂までと、戸塚中継所手前残り3km地点の急勾配をいかに攻略するかが最大のポイント。鶴見中継所では例年差がそれほどつかない為、ごぼう抜きや大ブレーキが頻繁に起こる区間でもある。エースの結果如何で後の流れが決まってくるとも言われる。
このコースでは前半ペースを上げ過ぎると権太坂と中継所手前の後半の登りで力尽き、ブレーキが掛かることがある。好タイム記録のためにはこの登りにいかに余力を残して臨むかがポイントとなり、1999年の三代直樹は残り3kmの上りを快走した。
区間記録保持者：佐藤悠基（東海大学 1年） 1時間02分12秒（第82回大会・2006年）
戸塚中継所→湘南新道→（藤沢）→国道134号→（茅ヶ崎）→（湘南大橋）→平塚中継所
遊行寺の坂を下り、浜須賀交差点を右折すると、湘南海岸に出る。全体的に海風を味方につけて、高速レースをものにしたい。また、地元大学の応援団が集結するのもこの区間。
従来はこの3区はつなぎの区間とされてきたが、近年は2区と3区をセットで考えることが多い。その為2区の流れを持続・もしくは躓きを取り返すために力のある選手を置くチームも多く、最近はこの区間でもごぼう抜きが見られるようになった。4区が最短区間に変更となったことで、更に重要度が増している。
東京から小田原までのコースは東海道線と接近している為、ファンは勿論、出場校の走り終えた選手やコーチ、監督、付き添いなどが電車を使って移動することが多い。従って、大会開催中は移動の車中で選手や監督などに遭遇することもある。
区間記録保持者：村上康則（順天堂大学 4年） 55分20秒（第82回大会・2006年）
平塚中継所→（国道1号）→（大磯）→（二宮）→（酒匂橋）→（小田原本町）→小田原中継所
区間距離が大会唯一20kmを切る最も短い区間。第82回大会にて、往路の小田原中継所が2.5km東京寄りに変更となった。
アップダウンが激しく、スピードが出にくい。ゆえに4区よりも3区にスピードランナーを置く学校も多く、この区間はチームの10番手の選手を起用する傾向になりつつある。
これらのことから、他の区間よりも区間距離が短い割りに1kmに平均3分以上かけて走る選手がほとんどである。1km平均3分を切って走った選手は区間記録を持つ村上（1km平均2分59秒46）と第84回大会（2008年）で55分24秒を記録した国士舘大学4年の阿宗高広（平均2分59秒68）しかいない。
4区短縮の背景には、中距離で活躍する選手にも箱根に出場する機会を与えたい、と言う関東学連の意向がある。
晴れた日には、選手の前方に富士山の雄大な姿を望むことができる。
区間記録保持者：今井正人（順天堂大学 4年） 1時間18分05秒（第83回大会・2007年）
新・小田原→旧・小田原→（箱根登山鉄道箱根湯本駅前）→（函嶺洞門）→（大平台ヘアピンカーブ）→（宮ノ下富士屋ホテル前）→（小涌園ユネッサン前）→（恵明学園前）→（芦の湯）→（国道1号線最高点）→（元箱根）→箱根・芦ノ湖（往路ゴール）
俗に「山上り」と呼ばれる最長区間。標高差864mをおよそ20kmで駆け上がるため、相当な脚力とスタミナが要求されるほか、向き不向きが最も如実に表れる区間。さらに82回から距離が長くなり、全区間最長となった。勿論、全区間の中で最難関でもある。近年ではこの5区での逆転劇がしばしば起きている。また、特殊な区間ゆえに大差がつきやすく、今後5区を走れる選手を置くことが総合結果にも直結してくる可能性がある。
山上りが注目される区間ではあるが、反対に最高点を過ぎた残り4kmの下りが勝負、といういわれ方もされる。事実、上りと下りでは使用する筋肉が異なるので向き不向きがあり、またいきなり筋肉にかかる負荷が極端に変わる事から、寒さも災いして中には下りで痙攣を起こして立ち止まる選手もいる。
小涌園手前には箱根登山鉄道の踏切があるが、選手が通過する際には列車を踏切の直前で止めるという協力的な措置がとられている。
5区および6区は非常に気温の低い山中を走る。平地とは温度差があるため5区6区を走る選手の中にはタンクトップではなく袖のあるユニフォームを着用することが少なからずある。
2004年（第80回大会）の金栗四三杯創設以来、5区で区間賞を取った選手が同賞を4大会連続で受賞している。
箱根・芦ノ湖→東京・大手町 5区間／109.9km
区間記録保持者：金子宣隆（大東文化大学 3年） 58分21秒（第77回大会・2001年）
箱根・芦ノ湖（復路スタート）→（国道1号）→（芦の湯）→（小涌園ユネッサン前）→（箱根登山鉄道大平台駅前）→（大平台ヘアピンカーブ）→（函嶺洞門）→（箱根湯本駅前）→小田原中継所