寛永5年（1628年）6月10日、水戸徳川家当主・徳川頼房の三男として水戸城下柵町（茨城県水戸市宮町）の家臣三木之次（仁兵衛）屋敷で生まれる。光圀の母は家臣谷重則の娘である久子で、『桃源遺事』によれば頼房は三木夫妻に対して久子の堕胎を命じたが、三木夫妻は主命に背いて密かに出産させたという。光圀を懐妊した際に父の頼房はまだ正室を持ってはいなかった。後年の光圀自身が回想した『義公遺事』によれば、母の久子は奥付きの老女の娘で頼房の寵を得て懐妊するが、頼房の側室であるお勝（円理院、佐々木氏の娘）がこれに機嫌を損ねたため頼房は堕胎を命じ、同じく奥付老女として仕えていた三木之次の妻武佐が頼房の准母であるお梶の方（お勝、英勝院）と相談し、密かに自邸で出産したという。また、光圀の同母兄である頼重出産の際にも同様の先例があったという。
『西山遺文』によれば幼少時には三木夫妻の子として育てられたと言われ、光圀の侍医井上玄桐の記した『玄桐筆事』には生誕後間もない光圀と頼房が対面していることを伺わせる逸話を記している。また、『桃源遺事』『義公遺事』『玄桐筆事』などの伝記史料には幼少時からの非凡を示す逸話が記されている。
寛永9年（1632年）に光圀と兄（頼重）の存在が明らかになり水戸城に入城した。翌寛永10年（1633年）11月に光圀は世子に決定し、翌月には江戸小石川藩邸に入り世子教育を受ける。世子内定の時期や経緯は諸書で若干異なっているが、頼房の付家老中山信吉（備前守）が水戸へ下向して行われており、3代将軍家光や英勝院の意向もあったという。翌寛永11年（1634年）には英勝院に伴われて江戸城で将軍家光に拝謁している。寛永13年（1636年）には元服し、将軍家光からの偏諱を与えられて光国と改める。
承応3年（1654年）には前関白近衛信尋の次女・尋子（泰姫）と結婚。明暦3年（1657年）、駒込邸に史局を設置し、紀伝体の歴史書である『大日本史』の編纂作業に着手する。
寛文元年（1661年）8月19日、常陸国水戸藩28万石の2代藩主となる。弟・松平頼元に常陸国那珂郡2万石（額田藩）を分与し、26万石となる。寛文3年（1663年）、史局を小石川邸に移し、彰考館とする。
延宝7年（1679年）、諱を光圀に改める（光圀52歳）[2]。元禄3年（1690年）10月14日に隠居し、藩主の座を退き綱條に譲る。元禄4年（1691年）、西山荘に隠棲した。元禄7年（1694年）11月23日、幕閣や諸大名を招いて行われた能舞興行の際、人払いをした密室で重臣の藤井紋太夫を刺殺した。72歳頃より食欲不振が目立ち始め、元禄13年（1700年）12月6日に食道癌のため死去。享年73（満71歳没）。
光圀は、兄（頼重）を差し置いて藩主になったことを後悔していたといわれ、後継に兄の子（綱方）を養子に迎え世継ぎとしたが、早世したためその弟・綱條を養子に迎え世継ぎとした。また、光圀には側室との間に実子（頼常）がいたが、この実子は兄の養子に出していた。
幼少時には、兄（頼重）を差し置いての世子決定が光圀の気持ちに複雑なものを抱かせたといわれ、少年時代は町で刀を振り回したりする不良な振る舞いを行っており、吉原遊廓通いも頻繁にしていた。しかし光圀18歳の時、司馬遷の『史記』伯夷伝を読んで感銘を受け、これにより学問に精を出すこととなる。しかしながらその強い性格、果断な本質は年老いても変わることはなかった。
光圀は、学者肌で非常に好奇心の強いことでも知られており、様々な逸話が残っている。
日本の歴史上、最初に光圀が食べたとされるものは、ラーメンをはじめ、餃子、チーズ、牛乳酒、黒豆納豆がある。肉食が忌避されていたこの時代に、光圀は5代将軍徳川綱吉が制定した生類憐みの令を無視して牛肉、豚肉、羊肉などを食べていた。さらに、野犬50匹を捕らえてその皮を綱吉に献上したこともある。
また、オランダ製の靴下（日本最古）を使用したり、ワインを愛飲するなど南蛮の物に興味を示し、朱舜水を招き、海外から朝鮮人参やインコを取り寄せ、育てている。蝦夷地探索のため黒人を2人雇い入れ、そのまま譜代の家臣にしてしまってもいる。
鮭の皮が好物で「厚さ一寸の鮭の皮を食べられれば死んでも良い」と語ったといわれる。さらに、吉原遊郭近郊の浅草界隈で見た手打ちうどんの技術を自ら身につけ、うどんを打つこともあったという。
当時の人物としては普通に衆道のたしなみもあった。光圀は政治を例えて「男色ではなく女色のようにしなければならない」と言った。女色は両方が快楽を得るが男色は片方だけ快楽であり片方にとっては苦痛でしかない。政治は女色のように為政者も民も両方が快楽を得るようにしなくてはならないという意味である。
『大日本史』完成までには光圀の死後250年もの時間を費やすこととなり、光圀の事業は後の水戸学と呼ばれる歴史学の形成につながり、思想的影響も与える。延宝2年（1674年）には、父・頼房の実母（お万の方）の墓参りと、頼房の准母（お勝の方）の三十三回忌供養のため、鎌倉に出向く。
