志摩国鳥羽浦の大里町で代々うどんの製造・販売を営む「阿波幸」の長男として生まれた。父は音吉、母はもと。幼名は吉松と名付けられた。父は商売よりも機械類の発明・改良に関心があり、明治14年（1881年）には粉挽き臼の改良により三重県勧業課の表彰を受け賞金100円を授与されている。祖父・吉蔵は「うしろに目があるような人」と言われたように、先が見え商才に恵まれていた。大伝馬船を10艘も持ち石材の運送で儲ける一方、家業のうどん屋のほか薪、炭、青物などの販売を手広く営み財をなしたと伝えられる。幸吉が晩年、「三つ子の魂は祖父に育てられた」と述懐している。明治維新によって職を失った失業士族の栗原勇蔵、岩佐孝四郎らに読み書きソロバン、読書などを習ったが正規の教育は受けていない。
早くから1杯8厘のうどんでは身代を築くのは無理と分かっていたようで、14歳で家業の傍ら青物の行商を始める。大きな目標を掲げる事で自分自身に課題を与え自らを鼓舞するところがあり、時として大法螺吹きといわれた。足芸（仰向けに寝て足の平で蛇の目傘を回す芸）の披露で、英国の軍艦・シルバー号へ青果や卵を売り込むのに成功した。また、マスコミを利用する点では今で言うヤラセにあたるような事も考え出し実行するような勇み足もあったともいわれている。
明治9年（1876年）の地租改正で、納税が米納から金納に変わったのを機会に米が商売の種になるとみて青物商から米穀商に転換。明治11年（1878年）には20歳で家督を相続、御木本幸吉と改名する。同年3月東京、横浜への旅により天然真珠など志摩の特産物が中国人向けの有力な貿易商品になりうることを確信、海産物商人へと再転身した。海産物商人としての幸吉は自らアワビ、天然真珠、ナマコ、伊勢海老、牡蠣、天草、サザエ、ハマグリ、泡盛など種々雑多な商品を扱う一方、志摩物産品評会、志摩国海産物改良組合の結成などに参加、地元の産業振興に尽力した。その後、志摩国海産物改良組合長、三重県勧業諮問委員、三重県商法会議員、などを務め地元の名士になっていた。
幸吉の飛躍の始まりは明治維新という時代背景がきっかけである。職業選択の自由、身分を越えた結婚が可能になり富国強兵のスローガンの下で海国日本の殖産興業政策により明治15年（1882年）、大日本水産会が創設された。明治14年（1881年）、結婚。妻・うめは当時17歳。鳥羽藩士族・久米盛蔵の娘で新しい学制の小学校とその高等科をでた才女であり、維新以前ではこの結婚は考えられなかった。明治15年（1883年）、父・音吉が54歳で死去。
世界の装飾品市場では、天然の真珠が高値で取引されており海女が一粒の真珠を採ってくると高額の収入が得られる事から、志摩ばかりでなく全国のアコヤ貝は乱獲により絶滅の危機に瀕していた。この事態を憂慮して明治21年（1888年）6月、第2回全国水産品評会の為上京した折、主催者である大日本水産会の柳楢悦を訪ね指導を仰いだ。幸吉は同年9月11日に貝の養殖を開始したが、真珠を生まない限り商品としての価値が低く経費倒れに終わった。この為発想を転換し「真珠の養殖」を最終目的に変え、その過程でアコヤ貝の生態を調べながら貝の養殖をすることで当初の目的が採算的にも果たされる事を計画。この目的の為に柳の紹介で東京帝国大学の箕作佳吉と当時大学院生だった岸上謙吉を明治23年（1890年）に訪ね、学理的には養殖が可能なことを教えられた。
中国の仏像真珠（胡州珍珠）にみられるように古来、真珠を産する貝の中に鉛などの異物を入れ、人工的に貝付き真珠を作り出す試みは中国や欧州各地で行われていた。しかし、幸吉の情熱と周囲の協力体制という点での取り組みが結果的に勝っていた事になる。
明治23年（1890年）、神明浦と相島（おじま、現在の真珠島）の2箇所で実験を開始した。この時小川多門、猪野三平等が協力した。問題は山積しておりアコヤ貝についての問題、どんな異物を貝に入れるか、貝は異物を吐き出さないか、貝は異物を何処に入れるか、その結果死なないか、貝そのものの最適な生育環境、赤潮による貝の絶滅への対応策等々である。その他の問題としては、海面及び水面下を利用する為の地元漁業者や漁業組合との交渉や役所との折衝には大変な苦労が伝えられている。
明治24年（1891年）、農商務省技手・山本由方による厳島（広島県）での真珠養殖実験を直接見聞。この時のアコヤ貝は英虞湾から幸吉らが移送に協力した。
明治25年（1892年）7月、東京帝大の佐々木忠次から貝の生存環境・養成上多くの示唆を得た。
明治26年（1893年）7月11日、実験中のアコヤ貝の中に半円真珠が付着している貝を発見。
明治29年（1896年）1月27日、半円真珠の特許（第2670号）取得で世の中に認知された第一歩となった。同年4月21日、妻・うめ32歳で死去。開拓者として当然の事ながら周囲は途方も無い事と感じ直接的に幸吉の作業を手伝う者は身近な親族だけであったが、特許取得をきっかけにまず親族が積極的に関わった。妻の実兄・久米楠太郎、幸吉の実弟（二男）・御木本松助夫妻、幸吉の実弟（三男）・森井常蔵夫妻、須藤卯吉、明治30年（1897年）秋には幸吉の実弟（五男）・斎藤信吉、明治32年（1899年）には竹内久吉、（猪野三平の子息）猪野若造、藤田嘉助、大谷幸助らが従業員として田徳島に移住、「海のものとも山のものともわからぬ事業に一身をかける人間は身内以外にはいなかった」と幸吉の四女・乙竹あいが後に語っている。その他桑原乙吉、次女みねの夫・西川藤吉、見瀬辰平、藤田輔世、藤田昌世らが加わる。西川（1874年 - 1909年）は東京帝大動物学科卒、農商務省に在籍し、箕作の下で真円真珠の科学的研究を行っていた。しかし明治42年（1909年）6月、惜しくも35歳の若さで不帰の人となった。
その後の特許をたどると、
半円真珠から真円真珠に到る特許
特に半円真珠に関わる加工上の特許（容飾真珠）
アコヤ貝養殖方法に関する特許（養殖籠・海底いけ籠）
大正13年（1924年・42歳）、母貝が子貝を生み育てる為の《仔蟲（しちゅう）被着器》の特許（この発明によって、アコヤ貝の全滅を救う当初の目的が達成されるようになった）
明治31年（1899年）、東京・銀座に御木本真珠店を開設する。
明治41年（1908年）、真円真珠の特許権を取得。