安政5年（1858年）4月大老に就任した井伊直弼（彦根藩主）は、条約問題と将軍継嗣問題を強権的に一気に解決をはかる。すなわち大老就任直後の6月、勅許の降りないまま井上清直・岩瀬忠震らにハリスとの間で日米修好通商条約を締結させた。領事裁判権を認め、関税自主権を喪失し、かつ片務的最恵国待遇を課した拙速な不平等条約であり、同様な条約がイギリス・フランス・オランダ・ロシアとも結ばれた（安政の五ヶ国条約）。また将軍職については、5月紀州慶福を後継に決定する。慶福は家茂と改名し、江戸城へ入った（将軍就任は10月）。
こうした井伊の強権的手法には反撥が相次ぎ、徳川斉昭・徳川慶勝（尾張藩主）・松平慶永らは抗議のため登城するが、無断で登城したことを理由に逆に井伊によって謹慎処分を受けることとなった。また、京都を中心に活躍した一橋派各藩の工作員らも井伊の指示を受けて、老中間部詮勝（鯖江藩主）らが取り締まりを行った。これにより、橋本左内・梅田雲浜・頼三樹三郎らが処刑され、また長州藩（萩）で私塾・松下村塾を開いていた吉田松陰なども、間部詮勝の暗殺を企てたかどで処刑された。これら一連の政治的弾圧を「安政の大獄」と呼ぶ。特に幕府・関白を介さず、朝廷から直接水戸藩へ勅書が出された件（→戊午の密勅）は井伊ら幕閣の警戒感を強め、水戸藩への弾圧は苛烈を極めた。
安政の大獄は、旧一橋派や攘夷派の反撥を招く。度重なる弾圧に憤慨した水戸藩や薩摩藩の浪士は、密かに暗殺計画を練り、万延元年3月3日（1860年3月29日）、江戸城登城の途中の井伊を桜田門の外で襲撃して暗殺を決行した（桜田門外の変）。政権の最高実力者に対する暗殺という結果は、幕府の権威を大きく失墜させることとなった。
開国・貿易開始以降、内外の金銀比価が違ったために発生した金貨の流出などにより諸物価が高騰、次第に開国策・不平等条約への批判が噴出し、外国人排斥の攘夷思想が次第に隆盛し、各地で異人斬りが横行する。また、国学思想から来る尊王思想と結びついて「尊王攘夷」運動として幕府批判へつながっていった。
井伊死後、老中の久世広周（関宿藩主）・安藤信正（磐城平藩主）らが幕政を主導し、失墜した幕府の権力を復活させるため、朝廷との提携（公武合体）を模索する。すなわち新将軍家茂と、孝明天皇の皇妹・和宮親子内親王との婚姻である。和宮は有栖川宮熾仁親王との婚約がすでにあり、外国人のいる関東へ行かせたくないと難色を示した孝明天皇も、公武合体には基本的に賛成であり、岩倉具視らの進言もあって最終的に家茂への降嫁を認めた。しかし、幕権強化のために朝廷を利用することは尊王派の怒りを買い、文久2年（1862年）正月、老中安藤は江戸城坂下門外で襲撃され、一命は取り留めたが後に失脚した（坂下門外の変）。
いっぽう、長州藩の長井雅楽が主導する「航海遠略策」が朝廷・幕府の賛同を得て、公武一和の具体策として急浮上する。長井は陪臣の地位ながら老中久世・安藤らから朝廷への周旋を依頼される。しかし、同藩の桂小五郎（のちの木戸孝允）や久坂玄瑞、久留米の神官・真木和泉ら尊王攘夷派は、幕府の権力強化につながるこの策に猛反対し、長井は失脚させられて、以後長州の藩論は尊王攘夷の最過激派へと転換される。
またこの時期、薩摩藩主の父で前藩主斉彬の弟・島津久光が、亡き兄の遺志を継ぎ、幕政改革を志して兵を率いて上京した。この動きを倒幕への準備と見誤った同藩の尊攘派が久光によって鎮圧される事件が発生したものの（→寺田屋騒動）、久光の朝廷工作により、幕府改革への勅使として大原重徳が遣わされるという事態となる。幕府側にはそれを拒否する力は無く、安政の大獄で失脚した徳川慶喜を将軍後見職、松平春嶽を政事総裁職、松平容保（会津藩主）を京都守護職とするなどの人事を含む改革を余儀なくされた（→文久の改革）。いっぽう久光率いる薩摩藩兵は帰国途中、生麦村で行列を横断しようとした英国人に斬りつける事件を起こす（→生麦事件）。
勅使に屈した幕府をさらに追い込むべく三条実美・姉小路公知ら尊王攘夷派の過激公卿が、長州藩などの勢力を背景に将軍に上洛を命ずる一方、攘夷の勅命を請願するなど、朝政を壟断しつつあった。将軍上洛を求める圧力に抗しきれず、文久3年（1863年）家茂は将軍としては200年ぶり（3代家光以来）の上洛を余儀なくされ、来る5月10日の攘夷決行を約束させられた。
約束の日である5月10日、長州藩は久坂玄瑞らの指揮の下、関門海峡を通過する外国商船に砲撃を加え、攘夷を決行する。しかし同月末に外国船に反撃され、砲台を占拠されるなど、実際には攘夷の困難さを身をもって知ることとなる（四国艦隊下関砲撃事件）。また藩兵の軟弱さを嘆いた長州藩士高杉晋作は、新たに武士以外の身分を含む奇兵隊などの諸隊を結成し、後の長州藩の武力となっていく。
また、生麦事件の賠償問題がこじれたことから7月2日薩摩藩と英国の間にも戦争が勃発（→薩英戦争）。善戦するも鹿児島市街の一部が焼失し、薩摩藩もまた攘夷の不可能性を悟ることとなった。