開国・貿易開始以降、内外の金銀比価が違ったために発生した金貨の流出などにより諸物価が高騰、次第に開国策・不平等条約への批判が噴出し、外国人排斥の攘夷思想が次第に隆盛し、各地で異人斬りが横行する。また、国学思想から来る尊王思想と結びついて「尊王攘夷」運動として幕府批判へつながっていった。
井伊死後、老中の久世広周（関宿藩主）・安藤信正（磐城平藩主）らが幕政を主導し、失墜した幕府の権力を復活させるため、朝廷との提携（公武合体）を模索する。すなわち新将軍家茂と、孝明天皇の皇妹・和宮親子内親王との婚姻である。和宮は有栖川宮熾仁親王との婚約がすでにあり、外国人のいる関東へ行かせたくないと難色を示した孝明天皇も、公武合体には基本的に賛成であり、岩倉具視らの進言もあって最終的に家茂への降嫁を認めた。しかし、幕権強化のために朝廷を利用することは尊王派の怒りを買い、文久2年（1862年）正月、老中安藤は江戸城坂下門外で襲撃され、一命は取り留めたが後に失脚した（坂下門外の変）。
いっぽう、長州藩の長井雅楽が主導する「航海遠略策」が朝廷・幕府の賛同を得て、公武一和の具体策として急浮上する。長井は陪臣の地位ながら老中久世・安藤らから朝廷への周旋を依頼される。しかし、同藩の桂小五郎（のちの木戸孝允）や久坂玄瑞、久留米の神官・真木和泉ら尊王攘夷派は、幕府の権力強化につながるこの策に猛反対し、長井は失脚させられて、以後長州の藩論は尊王攘夷の最過激派へと転換される。
またこの時期、薩摩藩主の父で前藩主斉彬の弟・島津久光が、亡き兄の遺志を継ぎ、幕政改革を志して兵を率いて上京した。この動きを倒幕への準備と見誤った同藩の尊攘派が久光によって鎮圧される事件が発生したものの（→寺田屋騒動）、久光の朝廷工作により、幕府改革への勅使として大原重徳が遣わされるという事態となる。幕府側にはそれを拒否する力は無く、安政の大獄で失脚した徳川慶喜を将軍後見職、松平春嶽を政事総裁職、松平容保（会津藩主）を京都守護職とするなどの人事を含む改革を余儀なくされた（→文久の改革）。いっぽう久光率いる薩摩藩兵は帰国途中、生麦村で行列を横断しようとした英国人に斬りつける事件を起こす（→生麦事件）。
勅使に屈した幕府をさらに追い込むべく三条実美・姉小路公知ら尊王攘夷派の過激公卿が、長州藩などの勢力を背景に将軍に上洛を命ずる一方、攘夷の勅命を請願するなど、朝政を壟断しつつあった。将軍上洛を求める圧力に抗しきれず、文久3年（1863年）家茂は将軍としては200年ぶり（3代家光以来）の上洛を余儀なくされ、来る5月10日の攘夷決行を約束させられた。
約束の日である5月10日、長州藩は久坂玄瑞らの指揮の下、関門海峡を通過する外国商船に砲撃を加え、攘夷を決行する。しかし同月末に外国船に反撃され、砲台を占拠されるなど、実際には攘夷の困難さを身をもって知ることとなる（四国艦隊下関砲撃事件）。また藩兵の軟弱さを嘆いた長州藩士高杉晋作は、新たに武士以外の身分を含む奇兵隊などの諸隊を結成し、後の長州藩の武力となっていく。
また、生麦事件の賠償問題がこじれたことから7月2日薩摩藩と英国の間にも戦争が勃発（→薩英戦争）。善戦するも鹿児島市街の一部が焼失し、薩摩藩もまた攘夷の不可能性を悟ることとなった。
この頃、京都へ尊王攘夷派の志士が集い、「天誅」と称して反対派を暗殺するなど、治安が極端に悪化。尊攘派の擡頭により朝廷・幕府政治の混乱が起きていることを憂えた孝明天皇の意をくみ、中川宮朝彦親王は極秘に会津藩・薩摩藩に長州藩の追放を命ずる。文久3年8月18日、宮廷の御門を制圧した会津・薩摩は、長州藩兵および三条ら7人の公卿を長州への撤退させるクーデタを決行し（八月十八日の政変、七卿落ち）、長州藩系の尊攘勢力の一掃に成功した。
いっぽう幕権強化・雄藩連合などの様々な思惑を孕みつつ、文久3年12月に徳川慶喜・松平春嶽・松平容保・伊達宗城（宇和島藩主）・島津久光による参預会議が開催され、神奈川鎖港談判、長州藩の処置、大坂港の防備強化などの議題が話し合われたが、将軍後見職の徳川慶喜の非協力的態度に春嶽・久光らが反撥して帰国したため、早くも翌年3月には崩壊。参預会議体制はわずか数ヶ月しか持たなかった。この後、朝廷から禁裏御守衛総督・摂海防禦指揮に任ぜられた慶喜は、京都守護職松平容保（会津藩主）・京都所司代松平定敬（桑名藩主）兄弟らとともに、江戸の幕閣から半ば独立した動きをみせることとなる（一会桑体制）。
この頃、各地で尊攘過激派による実力行使の動きが見られたが、いずれも失敗に終わっている。文久3年（1863年）8月大和では公卿中山忠光、吉村寅太郎・池内蔵太（土佐藩士）、松本奎堂（三河刈谷藩士）、藤本鉄石（岡山藩士）、さらには河内の大地主水郡善之祐らも加わった天誅組の変が勃発し、続いて但馬では沢宣嘉（前年京都から追放された七卿の一人）・平野国臣（福岡藩士）らによる生野の変が連鎖的に発生した。これらの事件は倒幕を目的とした最初の軍事的行動として、後世から見た歴史的な意味は大きいものの、この時点では無残な結末となった。
また土佐藩では武市瑞山が率いる土佐勤王党（前年に藩執政吉田東洋を暗殺）が弾圧され尊攘勢力は次第に後退していった。
さらに水戸藩では元治元年（1864年）3月、藤田小四郎・武田耕雲斎ら天狗党が筑波山で挙兵。