幼名は煕宮。天保11年（1840年）に立太子。弘化3年（1846年）の父・仁孝天皇の崩御を受け践祚した。父同様に学問好きな性格の持ち主で、その遺志を継いで公家の学問所である学習院を創設した。
嘉永6年（1853年）のペリー来航以来、幕府政治に発言力を持ち、江戸幕府大老井伊直弼が諸外国と独断で条約を結ぶとこれに不信を示し、一時は攘夷勅命を下したこともあった（文久3年（1863年）3月の攘夷勅命）。これを受けて下関戦争や薩英戦争が起き、日本国内では外国人襲撃など攘夷運動が荒れ狂った。孝明天皇は攘夷の意思が激しく、異母妹・和宮親子内親王を第14代征夷大将軍・徳川家茂に降嫁させるなど、公武合体運動を推進し、あくまで幕府の力による鎖国維持を望んだ。家茂が上洛してきたときは、攘夷祈願のために賀茂神社や石清水八幡宮に行幸している。京都守護職であった会津藩主松平容保への信任は特に厚かったと言われる。
しかし慶応元年（1865年）、攘夷運動の最大の要因は孝明天皇の存在にあると見た諸外国海軍は艦隊を大坂湾に入れて条約の勅許を天皇に要求して、天皇も事態の深刻さを悟って条約の勅許を出す事にした。だが、この年には実際には宮中のみに留まったものの西洋医学の禁止を命じるなど、保守的な姿勢は崩さなかった（もっとも、遺品として時計が残るなど、西洋文明を全く否定していた訳ではない）。
翌・慶応2年（1866年）12月25日、義弟・家茂の後を追うように、在位21年にして崩御。享年37（満35歳没） 。死因は天然痘と診断された。
孝明天皇と漢風諡号が贈られた。諡を持つ最後の天皇（明治以後の追号も諡号の一種とする場合もあるが、厳密には異なる）。
孝明天皇の埋葬にあたっては、文久の修陵で活躍した山陵奉行・戸田忠至（ただゆき）の建言を受け、従来の仏式葬の石塔から古式に改められ、歴代天皇墓所の泉涌寺内に円墳を模した後月輪東山陵（のちのつきのわのひがしやまのみささぎ）が築かれた。
平安京最初の天皇・桓武天皇を祀る平安神宮に、昭和15年（1940年、皇紀2600年）に平安京最後の天皇として合祀された。
慶應2年12月11日（1867年1月16日）、風邪気味であった孝明天皇は、宮中で執り行なわれた神事に医師たちが止めるのも聞かずに参加し、翌12日に発熱する。天皇の持病である痔を長年にわたって治療していた典薬寮の外科医・伊良子光順の日記よれば、孝明天皇が発熱した12日、天皇の執匙（日常の健康管理を行う主治医格）であった高階経由が拝診して投薬したが、翌日になっても病状が好転しなかった。14日、典医筆頭のひとりで、中山慶子の執匙を務める山本隨が治療に参加、15日には伊良子光順も召集され、昼夜詰めきりでの拝診が行われた。
12月16日（1月21日）、山本隨・高階経由・伊良子光順と、高階経由の息子・高階経徳の計4名で改めて拝診した結果、天皇が痘瘡（天然痘）に罹患している可能性が浮上する。
執匙の高階経由は痘瘡の治療経験が乏しかったため、経験豊富な西尾兼道・久野恭（いずれも小児科医）を召集して[2]拝診に参加させた結果、いよいよ痘瘡の疑いは強まり、17日に武家伝奏などへ天皇が痘瘡に罹ったことを正式に発表した。
これ以後、天脈拝診（実際に天皇の体に触れて診察すること）の資格を持つ13人に、西尾兼道と久野恭の2人を加えた15人の典医たちを下記の3班に分けて、24時間体制での治療が始まった。
第1班
筆頭：藤木篤平 （従四位上 典薬権助兼伊勢守）
執匙：高階経由 （従四位下 典薬少允兼安芸守）
山本正文 （従五位上 図書頭兼安房守）
高階経支 （従五位下 丹後守）
高階経徳 （正六位下 筑前介）
第2班
筆頭：山本隨 （従四位下 典薬大允兼大学助兼大和守、後に恭隨と改名）
河原実徳 （正五位下 典薬少属兼伊予守）
西尾兼道 （従五位上 土佐守、本来は小児科医だが痘瘡治療経験豊富のため召集）
大町淳信 （従五位下 弾正大弼兼周防守）
久野恭 （正六位下 出羽介、本来は小児科医だが痘瘡治療経験豊富のため召集）
第3班
筆頭：藤木静顕 （従五位上 近江守）
伊良子光順 （従五位上 織部正兼陸奥守）
福井登 （従五位上 主計助兼豊後守、後に貞憲と改名）
三角有紀 （正六位下 摂津介）
伊良子光信 （従六位上 阿波介）
孝明天皇の公式の伝記である『孝明天皇紀』においては、典医たちは、天皇の病状を「御容態書」として定期的に発表していた。これによれば、発症以降の天皇の病状は、一般的な痘瘡患者が回復に向かってたどるプロセスどおりに進行していることを示す「御順症」とされていた。
しかし、前述の伊良子光順の日記においては、翌25日の記録には、天皇が痰がひどく、藤木篤平と藤木静顕が体をさすり、伊良子光順が膏薬を張り、班に関係なく昼夜寝所に詰めきりであったが、同日亥の刻（午後11時）過ぎに崩御された、と記されている。
中山忠能の日記にも、「御九穴より御脱血」などと壮絶な天皇の病状が記されている。それでも天皇の喪は秘され、実際には命日となった25日にも、福井登の名前で「益御機嫌能被成為候（ますますご機嫌がよくなられました）」という内容の報告書が提出されている。天皇の崩御が公にされたのは29日になってからのことだった。
孝明天皇は前述の通り長年のあいだ悪性の痔に悩まされていたが、それ以外では至って壮健であり、前出の中山忠能日記にも「近年御風邪抔一向御用心モ不被為遊御壮健ニ被任趣存外之儀恐驚」（近年御風邪の心配など一向にないほどご壮健であらせられたので、痘瘡などと存外の病名を聞いて大変驚いた）との感想が記されている。