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稀に性的表現を含む動画がアップロードされている。そのような動画のアップロードはニコニコ動画並びにSMILEVIDEOの公序良俗を理由とした規約に違反している。そのため、発見次第削除されることとなっている。運営側ではどのような内容のものが公序良俗に反するのかについて明確な基準を示しておらず[8]、削除の際には、動画投稿者に事後にメールで通知される以外に削除理由の旨を告知することも無いため、一般ユーザーは何を理由に削除をされているのかが（建前上）分からないのが現状である。特にギャルゲーや萌えアニメ、やおいを取り扱ったコンテンツでの発生が多い。それらの削除選定は運営側の判断によるものが強い。また動画の削除選定はYoutubeほど整っているとはいえず例えば「Youtubeでは消されている動画がニコニコ動画では消されていない」、「動画を違反通報しても動画がなかなか消されない」、「動画の削除基準がYoutubeよりも甘い」等、悪質なユーザーに対するアカウント停止に対する処置はまだまだ甘いといえる。
ニコニコ動画と提携しているSMILEVIDEOにアップロードされているアニメ、ミュージカルライブ、テレビCM、テレビ番組などは、ほとんどの動画が著作権者に無断でアップロードされたものである。利用規約では著作権侵害になるファイルのアップロードを禁止しているが、著作権法違反の投稿は後を絶たないのが現状である。
権利者（個人、法人、法定代理人含む）から権利を侵害されているとの申し立てがあれば、審査し削除するとしている。その他肖像権などの権利侵害もこれに準ずる姿勢をとっている。性的描写を含むアダルトコンテンツは閲覧者の判断で報告できるが、こと著作権に関しては権利者からの申し立てのみ受け付けているため、アダルトコンテンツ程迅速な対応はされていない。
他の「動画共有サービスサイト」にも言える問題ではあるが、YouTubeでも著作権違反に関する規制が強化されているのに比べ、ニコニコ動画は登録制でクローズドな側面もあってか、著作権法を軽視する傾向にある。性的描写を含むアダルトコンテンツは迅速な対応・削除という運営側の対処に比べ、著作権法違反に関する動画がこのような対応がされるのは稀で、著作権違反動画の投稿禁止は表面上だけでほぼ黙認状態に近い、との指摘もある。
ただ、最近では連続アニメーション作品の本編や連続ドラマ作品の本編が多数アップロードされるなど、運営サイトも黙認はしていられない状況となっているためか、著作権侵害動画の削除（報告）ツールを法人向けに提供している[9]（2007年6月10日前後より、この申請方法によって削除された動画のページでは通常の削除通知動画とは異なった静止画が表示されている）。削除はあくまで被権利侵害者の報告のみ受け付けている。いわば権利侵害被害者の自助努力に任せる方法で、一部のコンテンツ制作者がこうした運営の手法をラジオ等で強烈な批判を成したこともあった。2007年10月1日には権利保護を強化する方針を発表、権利者との対話を強化し、権利保護システムや監視体制の強化、利用者への啓発活動に取り組むとしている[10]。ニコニコ動画 (SP1) 開始直後の2008年3月11日には、ニワンゴがNHKやキー局に対し、著作権侵害をしている既存の放送番組動画を削除し、監視体制を強めて今後再投稿されても直ちに削除する、との宣言を行った[11][12][13]。
しかし、自作物(完全なオリジナル作品)に対して著作者に成りすまして削除を依頼する可能性も指摘されている[14]。また著作権保護体制の強化で、インディーズバンドのPV、ライヴ映像を削除したところ、その動画のアップロード主がインディーズバンド本人であり、削除された本人がニコニコ動画に対し激怒していた、といった運営側による誤った削除が行われることもある[15]。2008年7月5日からは、権利者の申し立てにより動画が削除された場合、削除を申し立てた法人・団体の名前が明記されることになる[16]。ただし、今後増えるであろう個人の著作に関しての対応については名言されていない。
一方、2007年度の上半期に放映されたアニメでは、『らき☆すた』、『ハヤテのごとく!』、『さよなら絶望先生』といった作品において、明らかにニコニコ動画で視聴され、ネタにされている事を前提とした表現がなされており、アニメ制作の現場において、ニコニコ動画において作品が消費される事が意識されていることが垣間見られた。上記の削除時の仕様変更により、ニコニコにおける権利者の対応の差は今後さらに明白になっていくことが確実といえる。
2008年4月1日にJASRACと楽曲の使用についての契約を締結し、JASRACが管理する曲を演奏したり歌ったりした動画をアップロードすることが可能となった。ただ、アップロードが認められるのは「自分で演奏したり、自分で演奏しながら歌ったりした動画作品」であり、CDのカラオケトラックをそのまま使用して歌った場合などには、著作権侵害とされる可能性は高いので、打ち込みしたものを歌うなどの対策が必要。[17]
2008年7月2日には、社団法人日本映画製作者連盟、有限責任中間法人日本動画協会、社団法人日本映像ソフト協会の三団体からの要請を受けていたニワンゴがこれらの団体と協議し、ニワンゴから「これら三団体の会員各社の著作権を侵害する動画はMAD動画も含み速やかに削除する」ことが提案され、三団体が申し入れ書を受領したことが親会社ドワンゴより発表された[18]。ただし、近年では著作物を使用しない「手描きMAD」と呼ばれるタイプの動画も存在しており、「MAD」という線引き自体が曖昧な側面もある。
2007年5月2日、トップページが改変された際、いくつかのカテゴリタグが指定され、そのタグが付けられていない動画はトップページに上がってこないという仕様変更が、ユーザーへの通達を一切無くして突然行われた。しばらくしてブログにて正式発表があったが、ユーザーからは非難が殺到。その多くはタグの内容に関するものであった。タグのなかには「おもしろい」「つまらない」という、評価が個人的価値観に基づくものや、「R-18」という、本来は規約で禁止されているはずのものまで含まれており、これらの必要性や矛盾を指摘する声が多く上がった。これを受け、運営側はカテゴリタグを再び改変し、騒動は終息した。しかし、問題とされた「R-18」のタグは未だに存在している。これについては通常のテレビ放送で許される程度の動画であれば削除されないとのことだが、やはりその基準は曖昧である（性的表現を含むと判断された動画は今まで通り削除されている）。
2007年7月9日に運営により公式コンテンツとしてアップロードされた民主党の小沢一郎代表提供によるメッセージ動画では、運営側によるコメントの検閲が行われ、コメントの全削除、コメントを行ったユーザーへのコメント送信禁止措置（全ての動画に適用）やアカウントの剥奪などが運営側によって行われた。
