SP1現在のニコニコ動画は、動画を直接アップロードするサービスそのものではなく、他の動画投稿サイトにアップロードされた動画を独自のコメント表示・投稿機能を通して観覧させるというものである。SMILEVIDEOに動画をアップロードする（SMILEVIDEOはニコニコ動画専用のサイトであるため、アップロードするだけで自動的にニコニコ動画に登録される）ことで、ニコニコ動画内でその動画を見ることができるシステムとなっている。
βサービスまではYouTubeにアップロードされた動画にも対応しており、事実上、サイト上の大半の動画がYouTubeのものであった。しかし、ニコニコ動画からYouTubeのサーバーへのアクセスを完全に遮断されたため、βサービスの終了を余儀なくされ、γサービスとしての再開時には対応を完全に打ち切った。ここで、その代替として用意されたのがSMILEVIDEOである。なお、YouTube側はアクセスを遮断した理由に関して公式な発言をしていないが、ニワンゴはYouTubeのサービスに「ただ乗り」し、動画を直接参照する形でサービスを開始し、人気とともにアクセス数やトラフィックが爆発的に上昇したため、YouTubeのサーバに多大な負荷がかかってしまったことが理由と推測している[4]。
また、RCサービスの途中まではAmebaVisionにアップロードされた動画にも対応していたが、2007年10月1日に行われたメンテナンスを機に、運用上の理由から対応を終了した。SMILEVIDEOに規約違反の動画（違法なものや、わいせつなものなど）をアップロードしアカウントを停止されたユーザーが、その逃げ口として「AmebaVisionのアカウントを取得し、再び問題のある動画をアップロードする」という使われ方が横行したのを終了の理由としている。また、βサービス時はYouTube、γサービス以降はSMILEVIDEOが投稿の大半を占めており、AmebaVisionの動画の投稿が極めて少なかったことも理由のひとつと考えられる。
そしてフォト蔵にも対応していたが、2008年5月28日のメンテナンスを機に対応を終了した。
なお、リンク元サイトの元動画と比較して画質が異なるとの主張もあるが、再生しているFLVファイル自体および再生に使うFlashのシステムは同一であり、異なるのは表示倍率のみ（ニコニコプレイヤー上では512×384ピクセルで表示されるため、それよりもサイズの小さな動画は拡大表示される）である。
サイトの右上には、ニコニコ市場の購入速報や、ページのアクセントとして『今日のひと言』的なメッセージを表示するスペースが存在していた。毎日更新されるこのスペースはそのまま『右上』と呼ばれ、ユーザーに親しまれていた。当初は標語のようなメッセージが大半だったが次第にキャラクター性を帯びるようになり、ユーザーに対しコメントを残すパターンも多かった。 ⇒http://twitter.com/nicovideojp 右上リスト
しかし「ニコニコ動画(秋)」開始とともに右上は広告欄となり、結果的に右上は消滅したことになる（広告掲載が直接の原因ではなく、ページを開いた際に最初に見える『ファーストビュー』を重視した結果）。ただ、運営からの告知が行われる「ニコニコニュース」には「毎日沢山の一言案を書き込んでいただいていたので、場所を変えて再開する予定です」とあり、何らかの形で復活する可能性が高い。
ニコニコ動画の最大の特徴がこのコメント機能である。
コメントは動画再生中にコメントボタンを押すことで投稿順に記録され、投稿した時の再生位置から3秒間動画上に投稿が成功した直後から表示される。コメント投稿そのものに時間差があっても、動画内の時間軸においては常に書き込まれた時と同じタイミングで表示される（自分の投稿とそれ以前に書き込まれたコメントが並存する）ことになる。その結果、閲覧者はチャットや掲示板のような時系列とは異なる「実時間を超越した擬似的な時間共有」（運営側はこれを「非同期ライブ」と名づけている）を体感することが出来る。コメントに時間の概念を導入したことで、ニコニコ動画は従来の動画投稿には無い「利用者同士の一体感」を獲得することに成功している。
また、「コメントを表示しない」ボタンをチェックすることにより、すべてのコメントを一時的に非表示とすることも可能である。
その他にも、「マイメモリー」に動画を登録することでその時点のコメントを保存できる。保存したマイメモリーの閲覧時には、任意のコメントの表示・非表示を設定することも可能である。
γサービスまではコメントに投稿者の名前を付加することができたが、匿名掲示板のような感覚で気軽にコメントするユーザーが大半であったため、ハンドルネームを付加するユーザーはごくわずかであった。そのため、この名前欄は、「ニコニコ動画 (RC)」サービス開始と同時に廃止された。
通常のコメントは右から左へと流れていくだけで、文字色も白しかない。しかしコマンド機能を併用することですべての動画に対して文字色や文字の大きさ・表示方法などを数種類から選び、その動画の好きな位置に自由にコメントを行うことができる。コマンドはコメント入力欄の左側にあるボックスに入力（「big」「red」「ue」等）し、位置や色といった異なる属性同士であれば併用も可能。これを応用することで、コメントを利用して動画に字幕をつけることができる。また、コマンドと特殊文字（Unicode）などを複雑に組み合わせたイラストや巨大な文字はアスキーアートにちなみ「コメントアート」と呼ばれる。
1つの動画につき、再生時間1分未満で100件、1分以上5分未満で250件、5分以上10分未満で500件、10分以上で1000件のコメントまでが表示されるように構成されており、それを超えた場合には古いコメントから順に表示されなくなる構造となっている。なお、コメントは表示されなくなったものも含めすべてサーバに保持されており、プレミアム会員（有料会員。詳細は後述）であればすべてを閲覧することが可能である。この場合、日時を指定することで、その時に表示されていたコメントを閲覧するという格好になるため同時に表示される件数自体は通常と変わらない。
コメントの表示件数は、当初は全件を表示していたが、2006年12月19日に250件に制限され、2007年1月5日に動画の長さで3段階に切り替わる現在の仕様に変更されている。
投稿されるコメント内容は、おしなべてインターネット掲示板「2ちゃんねる」に通じる特徴が見られる。これは、ニコニコ動画のサービスを開始当初、2ちゃんねるの管理人である西村博之のブログで紹介されたことが利用者大幅増の要因となったことの影響を大きく受けている。もっともよく見られるコメントは、2ちゃんねる内でも広く使われている、笑いを意味する「w」（通称「草」あるいは「芝」）を笑いの度合いの数だけ並べたものである（例: 「wwwww」「ちょwww」など）。現在では、ニワンゴより公式的に用意された初心者向けの使い方解説動画の中で、「笑った箇所にはすすんで「w」をつけましょう」と公式的に案内されている[5]。
また、ときにはコメントやタグを使って、動画の内容に対する罵倒、他者に対する誹謗中傷や無意味な「荒らし」行為なども見られる。また、同一内容のコメントを同一時間に大量に投稿することで映像部分が見えなくなる場合がある（このコメントは一部では「弾幕」と称されている）。β版終了の原因となったトラフィック制限の関係上、現在はアカウント制であるが、動画へのコメント自体は匿名で自由に投稿することができる。管理者による削除も原則なされないため、通常のサイトでの荒らしが起こりやすいデメリットもあると言われている。ただし、投稿者のIDは投稿されたコメントと同時に保存（当初はID番号がそのまま保存されていたが、2007年8月23日より暗号化されている）されているため、完全な匿名ではない（現在では、後述の「NG設定」に投稿者のIDを指定することで、特定ユーザーのコメントをすべて非表示にすることが可能となっている）。 このような弾幕、荒らしといった迷惑行為が発生する要因として動画の上にコメントを無制限に書き込めるシステムそのものに問題があるといえる。
しかしながらコメント削除の可能性がまったくないわけではない。2007年4月15日頃より、DoS攻撃など、なんらかの攻撃ツールを使った攻撃により、わずか三日ほどで動画再生回数が数百万・うちコメント数万数千（コメント数に対して異常に再生数が多い）という事態に見舞われたため、再生回数とコメントがリセットされた動画が存在する。